Тканевые биосенсоры

     При измерениях in vivo возникают новые проблемы. В частности срок службы сенсора нередко ограничивается падением точности показаний. Вообще предполагается, что любая вводимая внутривенно или подкожно игла должна работать как минимум 24 часа (подкожные проводники или канюли обычно необходимо заменять максимум через 3 дня). В больничных условиях обычно предпочитают внешнюю градуировку по пробе крови. Однако необходима осторожность, если концентрации определяемых веществ в крови связывают с концентрациями в тканях больных. Глядя в будущее, можно предположить, что внешнюю градуировку имплантированного на длительный срок сенсора будут проводить с помощью капли капиллярной крови (вероятно, через специальное внешнее устройство). Однако такую градуировку нельзя проводить чаще одного раза в сутки (самим пациентом).

     МЕШАЮЩИЕ  ВЕЩЕСТВА.

     Проблема  неспецифичности биосенсоров в  связи с анализом биологических жидкостей общеизвестна. Биоинженерам важно понять, что концентрационный диапазон любого мешающего вещества в крови не совпадает с его физиологическим диапазоном. В крови тяжелобольных людей могут содержаться очень далекие от нормы количества глюкозы, кислорода, органических кислот, солей мочевой кислоты и т.д., а именно для таких пациентов прежде всего предназначен мониторинг in vivo. Кроме того, в медицине стало почти правилом применять множество лекарственных средств. Лекарственные препараты (и их метаболиты) являются еще одним потенциальным источником помех.

     АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ.

     Клиницисты  используют для анализа любые жидкие пробы, которые они могут получить из организма пациента, - мочу, спинномозговую жидкость, слюну, пот, выпоты и экссудаты, - но чаще всего кровь. Кровь - это биологическая жидкость, которую легче всего получить, особенно в экстренных ситуациях, и состав которой отражает химические изменения, происходящие в теле. К сожалению, при работе с кровью возникают две частные проблемы. Во-первых, переменная доля объема крови приходится на эритроциты (которые сами примерно на 30 % состоят из белка гемоглобина), внутренний состав которых отличается от состава плазмы. Во-вторых, кровь содержит ряд веществ, отобранных в ходе эволюции специально для взаимодействия с поверхностями. Эритроциты молено отделить от плазмы центрифугированием, но это требует времени и специального оборудования, а также может быть затруднен при малых объемах проб. Кроме того, механическое разрушение центрифужных пробирок может представлять реальную опасность для здоровья вследствие образования аэрозолей плазмы.

     Таким образом, сенсоры следует включать в системы, в которые поступает кровь; это позволяет оценивать содержание в плазме веществ, для которых не устанавливается быстрое равновесие через мембраны эритроцитов.

     БЕЗОПАСНОСТЬ  И НАДЕЖНОСТЬ.

      Казалось  бы, можно сказать, что прибор пригоден для медицины, если шансы спасения жизни с его помощью выше его опасности для жизни. Однако на практике эта простая идея не приемлема, даже если риск поддается количественной оценке, что обычно сделать трудно. Кроме того, в медицине лечение часто направлено на облегчение болезни (страданий), а не устранение угрозы смерти. Введение опасности для здоровья (жизни) вместо такого лечения или в качестве средства лечения чревато этическими и социальными осложнениями. Вообще, чтобы любой новый способ лечения или прибор стал приемлемым для медицины, выгоды от его использования должны намного перевешивать возможные проблемы.

     Ошибочные результаты Необходимо всегда иметь в виду возможность отказа любого сенсора. Отказ может приводить к ошибочному результату, а затем  к неверному автоматическому срабатыванию или информационному отклику сенсорной системы. Примером опасного отклика может быть чрезмерное усиление сигнала глюкозного in vivo сенсора, управляющего! системой подачи инсулина. Использование дома прибора для определения глюкозы в крови, дающего такую же ошибку, может привести к тому, что пациент предпримет опасные действия, корректируя обнаруженное "отклонение" от нормы. Точно так же, если из-за отказа прибора не обнаружено реальное отклонение от нормы, может случится, что врач не предпримет соответствующих мер в опасных для жизни обстоятельствах. Подходящими примерами здесь могут быть также случаи высокого содержания кетонов в крови (диабетический кетацидоз) или отравление парацетамолом.

     Сложные приборы для мониторинга in vivo могут включать схемы для обнаружения отказов электроники, хотя не может быть гарантий против ошибочного сигнала сенсора, если только не используются дублирующие сенсоры. В некоторых пределах сенсорные устройства можно программировать на определенные скорости изменения измеряемогопараметра с выдачей сигнала тревоги, если эти изменения выходят за допустимые границы. Следует, однако, учитывать, что ошибка измерения обычно растет быстрее, чем ожидаемые вследствие болезни изменения. Таким образом, при проектировании всех частей сенсорных приборов необходимо постоянно обращать внимание на надежность, ориентируясь при этом на самые высокие технические стандарты.

     Вынести суждение о приборах, предназначенных  для работы у постели больного или управляемых им самим, значительно труднее. Частично это связано с тем, что для массового использования таких приборов они должны продаваться по разумной цене. Частично ответ находится в руках самих врачей, которые должны убедить пациентов не реагировать на одиночный результат, который может привести к опасному изменению намеченного лечения, без обдумывания и, возможно, дополнительной проверки. 

     ТОКСИЧНОСТЬ.

     Совершенно  очевидно, что приборы для мониторинга  in vivo должны быть сделаны из нетоксичных материалов. Значительный коммерческий опыт накоплен в отношении композиционных материалов (металлов и пластиков), используемых в сердечных клапанах, водителях ритма сердца, протезных костей и кровеносных сосудов. Следует также обратить внимание на новые органические вещества, в том числе ферменты, которые могут выщелачиваться из сенсоров или так или иначе захватываться клетками - "сборщиками мусора" (макрофагами). Вполне вероятно, что при использовании биосенсоров может возникнуть и проблема активации иммунной системы - появления антител, приводящих к повреждению органов вследствие нарушения иммунной системы или амилоидоза. Эти проблемы можно частично решить, используя лишь допустимые для организма количества токсичных или антигенных веществ и удерживая большинство из них за диффузионными барьерами.

     МЕХАНИЧЕСКИЕ  ПОВРЕЖДЕНИЯ.

       Каждый разрез или прокол кожи есть нарушение анатомической целостности, а любое продвижение в глубь тела сопряжено еще с большим риском нарушения жизненных функций. Сенсоры, помещенные в подкожную ткань и связанные с проходящими через кожу проводами, являются "входными воротами" для инфекции. Поэтому они должны быть стерильными и заменяться каждые 1-3 дня. Риск инфекции еще выше для приборов, помещенных в кровеносную систему. Однако из-за сложности процедуры введения таких приборов в вену их регулярная замена возможна практически только в отделении интенсивной терапии или операционной. Следовательно, такие приборы следует имплантировать целиком и рассчитывать на большой срок службы (более двух лет). Кроме того не до конца выяснена опасность тромбоза. Из опыта применения проводников водителей ритма сердца вытекает, что в кровеносный сосуд нельзя вводить что-либо выступающее за его стенки. Это может серьезно ограничить возможности сенсора!

     При внутримышечном использовании сенсорных  приборов имеется риск их механического разрушения вследствие длительного пребывания в постоянно движущейся среде при 37 °С.

     По  всем этим причинам сенсоры, предназначенные  для постоянного нахождения в мышечной ткани человека, должны испытываться в течении ряда лет на собаках и свиньях; лишь тогда они могут быть одобрены контролирующими органами. 

ТКАНЕВЫЕ  БИОСЕНСОРЫ.

     В данной работе рассматриваются в  основном тканевые биосенсоры, которые появились сравнительно недавно, однако привлекают все большее внимание исследователей простотой конструкции, низкой стоимостью, высокой каталитической активностью и сравнительно продолжительным временем жизни. При разработке такого типа биосенсоров используются данные о том, что растительные и животные ткани содержат специфические наборы ферментов, которые могут быть использованы как катализаторы соответствующих химических реакций. Например, листья, цветки и плоды растений (структуры, связанные с ростом, репродукцией и накоплением питательных веществ) не только богаты каталитическими веществами, но и различаются по качественному составу. Для иммобилизации используют гомогенаты или срезы тканей, фиксируя их на поверхности трансдуктора. В результате ферментативной реакции, протекающей в ткани, выделяются вещества, концентрация которых определяет величину выходного сигнала трансдуктора, в качестве которого чаще всего используется газочувствительный хемосенсор.

     Селективность тканевых сенсоров иногда снижается  за счет присутствия в тканях не одного а нескольких ферментов. Однако влияние "лишних" ферментов в каждом конкретном случае можно исключить или значительно ослабить подбором рН, температуры среды либо с помощью соответствующих ингибиторов и стабилизирующих компонентов ферментативной активности. С другой стороны, наличие в ткани разных ферментов позволяет в некоторых случаях использовать один биосенсор для измерения концентрации нескольких субстратов.

     К настоящему времени разработаны тканевые биосенсоры на целый ряд диагностически значимых веществ: мочевину, катехоломины, аминокислоты и др. Для некоторых из них описано несколько разных биосенсоров, как, например, для перекиси водорода. С. Lu и соавт. предложили амперометрический биосенсор на основе ткани листа кольраби. Гамогенат ткани с добавлением ферроцена (медиатора переноса электронов) иммобилизовали в графитовой смоле на угольном электроде. Содержащаяся в кольраби пероксидаза катализирует восстановление перекиси водорода до воды ферроценом, а образующийся на электроде (-200 мВ) феррициний вновь восстанавливается в ферроцен. Область определения концентрации перекиси водорода 4* 10^-5 - 6*10^-4 М, время отклика 2-6 с, предел определения 8,4*10^-6 М. Биосенсор с использованием ткани винограда позволяет измерять концентрацию перекиси водорода в диапазоне 1*10^-5-5*10^-4 М при времени отклика 1 мин. Еще один биосенсор на перекись водорода содержит эритроциты человека. Чувствительность сенсора 1*10^-4 М, диапазон линейности 1,5*10^-4-5*10^-3 М, время жизни 2 мес.

            Разработано несколько биосенсоров  на перекись водорода различающихся по способам иммобилизации ткани корней хрена. Проведен 
сравнительный анализ этих сенсоров по основным параметрам. Лучшими характеристиками обладает сенсор с растительной тканью, иммобилизованной на фотомембране на основе n-азидотетрафторбензальдегида: диапазон линейности от 9*10^-5 до 6*10^-3М при пределе обнаружения перекиси водорода 9*10"⁶ М, время отклика не менее 3 мин, время жизни более 2 мес. В качестве трансдуктора был 
использован кислородный зонд. Описанные биосенсоры могут быть 
применены не только для измерения концентрации перекиси водорода. 
На их основе возможна разработка целого комплекса комбинированных 
биосенсоров для определения субстратов, в результате реакций разложения которых (катализируемых их оксидазами) образуется перекись 
водорода - L-аминокислоты, глюкоза, лактат и др. С помощью сенсора 
на основе растительной ткани корней хрена можно определять концентрацию перекисей не только в водных растворах, но и в органических 
растворителях.

     Описан  также биосенсор на основе срезов ткани печени свиньи, содержащей в  значительных количествах фермент  разложения перекиси - каталазу.

     Перекись  водорода образующаяся в ходе многих ферментативных реакций, является токсичным веществом и в норме инактивируется каталазой и пероксидазой. При генетически детерминированных патологиях, связанных с изменением активности этих ферментов, происходит накопление Н₂О₂, что приводит к развитию некоторых заболеваний (например, акаталазии). Известно также, что подобным эффектом определенных фармакологических веществ является их влияние на активность ферментов, катализирующих разложение ряда субстратов (L-аминокислот, глюкозы, лактата и др.) с образованием перекиси водорода. Таким образом, определение концентрации Н₂Ог необходимо при постановке диагноза, а мониторинг этого параметра требуется для контроля действия фармакологических препаратов в процессе лечения.

     Несколько тканевых биосенсоров создано для определения концентрации катехола. Один из них включает ткань баклажана, содержащую окислительный фермент полифенолоксидазу (ПФО). Другой сенсор основан на присутствии ПФО в картофеле. Тонкий срез картофеля (100 мкм) фиксируется на кислородном электроде. Реакция

     идет  с потреблением кислорода. Для этого  биосенсора время отклика меньше 3 мин, линейный диапазон 2,5*10^-5 - 2,3*10^-4 М, время жизни 3 мес. В основе еще одного биосенсора на катехол, включающего ткань листа шпината, лежит другая химическая реакция, катализируемая ферментом катехолоксидазой (КО):