МАЛДИ спектроскопия сложных соединений

^{Введение}

^{МАЛДИ спектроскопия сложных  соединений…………………………………………………………………3}                       

^{Основы  масс-спектрометрии…………………………………………………………………………………….4}

^{Основные  принципы времяпролетного  масс-спектрометра……………………………………………….5}

^{Времяпролетный  масс-спектрометр  с рефлектроном………………………………………………….…..9}

^{Калибровка……………………………………………………………………………………………………..…14}

^{Важность матрицы……………………………………………………………………………………………….15}

^{Приготовление образцов……………………………………………………………………………………….17}

^{Проведение анализа…………………………………………………………………………………………….20}

^{Литература………………………………………………………………………………………………………...23}

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

^{МАЛДИ спектроскопия сложных  соединений.}

^{Лазерная десорбционная  ионизация в присутствии матрицы (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation – MALDI) была открыта независимо Ф.Хилленкампом с М. Карасом и К.Танаке в 1988 году как метод, позволяющий переводить высокомолекулярные, труднолетучие, нестабильные молекулы в газовую фазу в виде неповрежденных ионов.  Метод заключается в облучении короткими лазерными импульсами образца, представляющего собой твердый раствор анализируемого соединения в органической матрице. Матрица выбирается таким образом, чтобы ее молекулы активно поглощали фотоны, эмитируемые УФ- или ИК-лазером. Над поверхностью образца создается плотная высокотемпературная плазма, в которой наряду с молекулами и ионами матрицы оказываются и молекулы анализируемого соединения. Ионизация последних путем}

^{поглощения  энергии фотонов  или в результате ионно-молекулярных реакций приводит к образованию положительных и отрицательных ионов, которые выталкиваются высоким потенциалом из области ионизации и направляются в анализатор.} 

^{Метод характеризуется  интенсивными пиками молекулярных ионов  разного типа и низкой фрагментацией. В настоящее время методом МАЛДИ успешно анализируются пептиды, белки, нуклеотиды, полисахариды, синтетические полимеры, гуминовые кислоты, фуллерены, органические комплексные соединения и другие натуральные продукты с молекулярными массами до нескольких сотен тысяч Дальтон. Важнейшими параметрами метода являются природа матрицы, количественное соотношение матрица/анализируемое соединение, способ приготовления образца, длина волны, долгота импульса и мощность лазерного излучения.}

^{Обычно, в МАЛДИ  эксперименте используется ультрафиолетовый азотный  лазер с}

^{длиной  волны 337 нм, с длиной импульса от десятых  до единиц наносекунд и мощностью}

^{лазерного излучения в диапазоне  - .}

^{Чаще всего  метод МАЛДИ используется во времяпролетных масс-спектрометрах (time-of-flight mass spectrometers TOF-MS). Необходимое условие для работы такого масс-спектрометра – это наличие высокого вакуума. Давление 10 - Торр является типичным для времяпролетных масс спектрометров.}

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

^{Основы  масс-спектрометрии.}

^{Масс-спектрометрия  является физико-химическим методом анализа, заключающимся в  переводе молекул  образца в ионизированную форму с последующим разделением и регистрацией образующихся при этом положительных или отрицательных ионов. Масс- спектр позволяет сделать выводы о молекулярной массе соединения, его составе и структуре.}

^{В случае графического изображения масс-спектра (масс-спектр может быть представлен и в виде таблицы) по оси абсцисс откладывается величина отношения массы иона к его заряду (m/z), а по оси ординат – их интенсивности, т.е. относительное количество ионов данного вида. В качестве единицы размерности массы в масс-спектрометрии используются атомные единицы массы (а.е.м.) или Дальтоны (Да), которые определяются как 1/12 массы атома. Так как большинство ионов несет единичный заряд, то термин «отношение массы иона к его заряду» обычно заменяется «массой». (Это справедливо только для однозарядных ионов, которые обычно реализуются в методе МАЛДИ, но не для двух и более зарядных ионов. Например, для}

^{молекулы  с весов 1000 Да, соответствующий  ей однозарядный ион  появится в спектре при 1001 Да, но дважды заряженный ион той же молекулы будет появляться при 501 Да).} 

^{Масс-спектрометр  состоит из пяти главных  компонентов: ввода  образца, ионного источника, анализатора масс, детектора и прибора для регистрации спектра. В современных приборах управление всеми операциями, а также обработку результатов осуществляет компьютер.} 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

^{Основные  принципы времяпролетного  масс-спектрометра.}

^{При лазерном облучении  образца внутри ионного  источника образуются газообразные ионы. Затем все ионы ускоряются приложением электростатического поля, приобретая, в идеале, ту же самую кинетическую энергию, и выталкиваются в бесполевое пространство (область дрейфа), где физически разделяются друг от друга на основе их отношений массы к заряду (m/z). Специальный детектор регистрирует время прибытия и интенсивности сигналов групп масс разрешенных ионов. При фиксированной кинетической энергии ионы с малыми массами двигаются быстрее ионов с большими массами. Ионы матрицы и легкие пептиды приходят к детектору первыми, а затем более тяжелые протеины, в соответствии с увеличением отношения m/z.}

^{= U * z * e = m, где}

^{– полная кинетическая энергия, U – ускоряющий электростатический потенциал,} 

 ^{v – скорость, которую приобретают ионы с отношением масса/заряд - m/z. Этот результат является фундаментальным отношением между отношением массы к заряду и временем пролета иона.}  

^{= ∞ =>t∞}

                         

^{Это простое отношение  позволяет определять массы ионов  из их времени пролета после калибровки прибора.}

^{Простейшей конфигурацией  времяпролетного  масс-спектрометра является его линейная мода.} 

        

^Рис.1

^{Все десорбированные ионы ускоряются на коротком расстоянии d при помощи электрического поля U/d .  Ионы массой m и количеством z элементарных зарядов е ускоряются силой:} 

^{F = m * acc = * z * e , где асс – ускорение, зависящее от}

^{массы. Время пролета  за время ускорения можно вычислить из:}

^{d = *   , где}

^{d – расстояние между мишенью образца, находящейся при ускоряющем потенциале U и заземленной ускоряющей сеткой.}

^{= d *}

^{Время дрейфа иона во времяпролетной трубе длиной L между ионным источником и}

^{детектором:}

^{= L *}

^{Тогда полное время пролета  иона внутри линейного  времяпролетного  масс-спектрометра} 

^{есть  сумма этих двух времен:}

^{t = + = d * + L *}

                                   

^{Если точные значения d и L неизвестны, то уравнение можно привести к виду:} 

  ^{= const *     , что является уравнением времяпролетного масс-спектрометра.}

^{Реально измеренное время всегда немного отличается от реального времени}

^{пролета из-за существования времени задержки   детектирующей электроники}

^{(Обычно, для регистрации  сигнала используются  высокоскоростные  детекторы на основе}

^{микроканальных  пластин и АЦП, регистрирующие спектры со скоростью 5 *}

^{измерений в секунду и  лучше).} 

^{Если  известны времена  пролета и массы  двух ионов, то эти  данные могут быть}

^{использованы  для получения  калибровочной функции  с двумя постоянными  калибровки:}

^{m/z = const (U) * => = a * + b , где const(U)}

^{есть калибровочная постоянная пропорциональная ускоряющему напряжению.}

^{Ограничением  применения линейных масс-спектрометров  является их относительно низкое разрешение по массам из-за разброса ионов с одной массой по времени, по скорости (энергии) и в пространстве.} 

^{Использование импульсных лазеров для генерирования  ионов позволяет достаточно эффективно работать на линейных времяпролетных приборах, так как в этом случае время создания ионов ограничивается длительностью импульса, т.е. разброс ионов по времени имеет конечное значение, причем, чем короче импульс, тем меньше разброс.}

^{Разброс по энергиям связан с тем, что ионы, образующиеся при  облучении образца лазерным излучением, двигаются от мишени  со скоростями ~200-1000 м/с, и ионы имеющие то же соотношение массы к заряду будут иметь различные начальные скорости и различную кинетическую энергию ∆ до 100eВ. Начальные скорости ионов зависят от материала матрицы и от мощности лазерного излучения. В результате полная энергия движения ионов в области дрейфа будет ( ± ∆).} 

^{Пространственный  разброс связан с  тем, что ионы в  источнике находятся  не на одной линии, а занимают конкретный объем. Часть их оказывается ближе к сетке, а часть дальше. Если обозначить это отклонение в пространстве ∆d, и, учитывая, что U=E*d (где Е- напряженность электрического поля), то получается, что энергия ионов в области дрейфа равна eE(d ± ∆d), что так же приводит к разбросу по энергиям и, следовательно, к уширению сигнала и потери разрешения.} 

^{В методе МАЛДИ  происходит генерирование  ионов с поверхности, в результате устраняется не только разброс образования ионов во времени, но и в большой степени пространственный разброс, наблюдающийся при использовании методов ионизации молекул в газовой фазе.} 

^{Для устранения разброса по энергиям и повышения разрешающей  способности линейных анализаторов был предложен метод времени задержки выталкивания ионов из источника. В этом методе образец облучается импульсным лазерным излучением в отсутствии выталкивающего электрического поля. В течение времени задержки ионы дрейфуют с начальной скоростью, полученной в процессе десорбции. Ионы с большей скоростью дрейфуют быстрее ионов, обладающих меньшей скоростью, и, следовательно, перемещаются дальше от точки десорбции. После некоторого времени задержки () прикладываемое импульсное напряжение создает электрическое поле и ускоряет ионы. В результате ионы с меньшей начальной скоростью оказываются в точке с большей напряженностью электрического поля, получают больше энергии от электрического поля и достигают детектор в то же время, что и ионы с большей начальной скоростью, но}

^{получившие  меньшее ускорение, при условии, что  время задержки и  величина электрического импульса выбраны правильно. В целом, если условия поведения эксперимента поддерживаются постоянными, то} 

^{• Оптимальное  время задержки зависит  от m/z, т.е. эффективная фокусировка ионов в области детектора осуществляется только для узкого диапазона m/z. Для фокусировки ионов с более высокими массами (~20000Да) требуется увеличение времени задержки. Для ионов низких и средних масс (1000-10000 Да) время задержки приблизительно пропорционально m z .}

^{• Ионы с большими массами будут  лучше фокусироваться с увеличением амплитуды выталкивающего импульса при сохранении постоянным времени задержки.}

^{• Время задержки уменьшается с  увеличением амплитуды  выталкивающего импульса.}

^{Так как область  масс, которые можно  сфокусировать, расширяется  при увеличении амплитуды выталкивающего импульса, то полезно выбирать самое большое значение выталкивающего импульса и самое короткое время задержки, которые поддерживаются спектрометром в интересуемой области масс.  Революционным решением проблемы улучшения разрешения спектрометров (для области малых и средних масс) стало использование отражателя (рефлектрона, ионного}

^{зеркала), предложенное Б.А.Мамыриным.} 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

^{Времяпролетный  масс-спектрометр  с рефлектроном.}

^Рис.2

 

^{В рефлектроне при помощи электростатического поля ионы отражаются под небольшим углом в направлении детектора рефлектрона. Из группы ионов с одной массой частицы с большей кинетической энергией проникают глубже внутрь отражающего поля рефлектрона, тем самым, затрачивая больше времени на замедление и последующее ускорение. Первыми достигая ионного зеркала, они последними покидают его и догоняют более медленные ионы в фокальной плоскости, в которой располагается детектор.}

^{Такой принцип  приводит к значительному  увеличению разрешения времяпролетных приборов с рефлектроном по сравнению с линейными спектрометрами и увеличивает точность определения масс. Сперва появились рефлектроны с одним однородным отражающим полем (одноступенчатые рефлектроны). В них достигалась фокусировка по энергии только первого порядка, для получения второго порядка фокусировки, который необходим для высокого разрешения при большом энергетическом разбросе, используются двухступенчатые рефлектроны, в которых прикладывается второе однородное поле. В таком рефлектроне ионы замедляются на первой ступени рефлектрона и отражаются и точно фокусируются на второй ступени.}

^{Так же как и  для линейной конфигурации, отношение массы  к заряду может  быть вычислено из времени пролета.}

^{m/z = const(U,UR) * , где const(U,UR) –}

^{калибровочная постоянная, зависящая  от напряжений ускорения  и рефлектрона и   - время задержки детектирующей электроники в моде рефлектрона. Рефлектроны, в отличие от метода времени задержки, дают фокусировку, которая не зависит от массы. Однако они не могут быть использованы для анализа больших протеинов, так как метастабильный распад ионов усложняет вид времяпролетного спектра: пики уширяются, изменяется их форма (появляются горбы и плечи на склонах пиков), появляются дополнительные пики от фрагментных ионов. Метастабильные ионы – это ионы, которые образуются из возбужденного молекулярного иона во время его полета в бесполевом пространстве. Такие ионы имеют ту же скорость, что и родительские, но меньшую массу и, следовательно, меньшую кинетическую энергию. В результате они находятся в отражающем поле рефлектрона меньшее время и приходят на детектор раньше родительских ионов, но позже ионов, обладающих той же массой с самого начала. Меняя напряжение рефлектрона можно зарегистрировать все фрагментные ионы и получить их массы. На этом принципе основан метод Post Source Decay.}