МАЛДИ спектроскопия сложных соединений

^{Рефлектроны также имеют меньшую чувствительность и хуже отношение сигнала к шуму по сравнению с линейной модой.} 

^{Чувствительность времяпролетного МАЛДИ спектрометра определяется минимальным количеством молекул образца, которое еще дает детектируемый ионный сигнал в масс-спектре. Обычно чувствительность находится в диапазоне наномолей для малых пептидов (доходит до фемтомолей) и в диапазоне микромолей для более тяжелых протеинов. Чувствительность прибора сильно зависит от качества приготовления образца.} 

^{Разрешение – это возможность различать ионы с разными отношениями заряда к массе. Возможность различать один от другого два иона с похожими отношениями m/z прямо связана с возможностью разделить два пика, соответствующие этим ионам, в масс-спектре. Обычно разрешение определяется как R=m/∆m, где ∆m-разность масс между соседними пиками, которые разрешены и m-масса первого пика (или средняя масс двух пиков). Хотя это определение дано для двух пиков, возможно определять разрешение и для одного пика, как это делается в случае МАЛДИ времяпролетных измерений. В этом случае ∆m – это ширина пика на половине высоты пика соответствующей массы. Разрешение времяпролетного масс-спектрометра определяется как    = * , где m - масса или m/z иона, ∆m – это ширина пика на половине высоты, t – время пролета иона, ∆t - полная ширина сигнала на половине высоты. Это выражение следует из уравнения времяпролетного спектрометра. Как упоминалось выше, разрешающая способность времяпролетных масс-спектрометров ограничена, в основном, тремя параметрами:} 

^{1. Распределения   времени ионизации  и времени детектирования  ∆: они обычно не изменяются при данных условиях эксперимента, их влияние уменьшается с увеличением времени полета, т.е. для более высоких масс, большей области дрейфа L или меньшей величины ускоряющего потенциала U:}                             

^{2. Из модели  распространения  сверхзвуковой струи,  применяемой для  описания десорбции нейтралей, в которой все десорбируемые молекулы имеют одинаковую скорость v и распределение скорости ∆v, следует, что начальное (термическое) распределение скорости приводит к дополнительной относительной ошибке (‘turnaround-time”):   , где U/d есть напряженность поля в области локализации молекулы. Влияние m и U  обратно по сравнению с ошибкой от разброса по времени ионизации и детектирования.}

^{3. Энергетическое  распределение, обусловленное  начальной скоростью  и разбросом положения места ионизации внутри ионного источника, постоянно и не зависит от массы и длины дрейфа:}

^{Полная  относительная ошибка может быть вычислена  по следующей формуле  для линейной моды спектрометра:}

^и

^{для моды рефлектрона, где относительной ошибкой обусловленной энергетическим распределением можно пренебречь по сравнению с двумя другими факторами из-за фокусирующих свойств рефлектрона.} 

^{На практике разрешение зависит от конструкции  прибора, типа образца, процедуры приготовления образца и мощности лазера, которая используется:} 

^{• Однородное распределение  на мишени малых кристаллов образца обычно дает}

^{наилучшие результаты, также  важна высокая  чистота материала  матрицы. • Обычно используется мощность лазерного излучения,  немного превосходящая порог появления ионов.  Использование лазерного излучения большой мощности следует избегать,  так как это вызывает:}

^{1) разрушение  образца,  что увеличивает образование фрагментных ионов;}

^{2)  изменяет  место положения  образования ионов в источнике,  что приводит к смещению центра тяжести регистрируемой массы в область более высоких масс.}

 ^{Оба эти  эффекта приводят  к уменьшению интенсивности сигнала, неправильному положению центра масс пика и уменьшают разрешение.}

^{Типичное разрешение для времяпролетного  МАЛДИ спектрометра,  работающего в}

^{линейной  моде,  есть 5000 - 6000,  а в моде рефлектрона оно достигает значений в три - четыре раза больших.}

^{Важной характеристикой  масс-спектрометров  также является точность, с которой можно определить массу. Точность определения масс зависит от типа образца, конструкции спектрометра, процедуры приготовления образца и метода калибровки оси масс прибора. Точность определения массы обычно определяется как относительная ошибка в процентах (%) или в «частях на миллион» (ppm). Например, моноизотопная масса пептида брадикинина есть 1060.5692 Да, и если для него была померена масса 1060.6201Да, то точность измерения массы будет:} 

^{Сейчас  современные приборы  дают возможность  получать спектры  масс с точностью, лежащей в области  десятков и единиц ррм.}

^{На точность определения  масс сильно влияет разрешение прибора.  Ниже приведены два спектра протонированного иона пептида брадикинина  (суммарная формула: ),  которые были получены с разрешением m/∆m равным 1000  и 5000.}

                                      ^{Рис. 3а                                                              Рис. 3б}

  ^{Такие сложные формы спектров связаны с тем,  что большинство существующих в природе элементов имеют более одного изотопа.  Профиль пика на рис.3а определяется суммарным вкладом распределения изотопа ,  тогда как на рис.3б пики, соответствующие изотопному распределению разделены на отдельные сигналы (расстояние между пиками составляет примерно 1  Да,  что соответствует разнице масс между изотопами и ). Более тяжелые изотопы азота и кислорода тоже вносят вклад в изотопное распределение,  но наибольший вклад дает изотоп ,  так как в высокомолекулярных соединениях более 50% молекулярной массы вещества приходится на углерод, а также  изотоп имеет наибольшую вероятность распространения. Первый пик на Рис.3б соответствует моноизотопной массе иона.  Моноизотопная масса – это масса,  рассчитанная суммированием точных атомных масс наиболее распространенных}

^{(легких)  изотопов элементов  (т.е.  только один  изотоп каждого  элемента включается  в полную массу).  Моноизотопные массы определяются восьмью – девятью значащими цифрами.   Так как моноизотопная масса брадикинина - 1060.5692  Дa,  то точность ее определения 0.1ррм, а средняя масса (сумма средних атомных весов всех элементов иона) - 1061.24Да (шесть значащих цифр) и точность ее определения ограничивается 100 ррм.  С увеличением массы органической молекулы увеличивается вероятность присутствия изотопов и тяжелых изотопов других элементов. Вероятность распространения изотопа в природе более 1%, т.е. для любых 100 атомов углерода один из них будет . Брадикинин содержит 50 атомов углерода, и как видно из рис.3б, приблизительно 40% молекул брадикинина содержат изотоп . Вероятность того, что в}

^{молекуле, содержащей 50 атомов углерода, будет 0 атомов – около 60%, 1 атом – около 30%, 2 атома – около 10 %. Когда количество углеродов увеличится до 131, как в пептиде мелиттин, вероятность того, что каждая молекула будет иметь изотоп , становится больше 100% , и пик становится наиболее интенсивным в спектре (см. Рис.4). Молекулы инсулина и цитохрома С имеют 254 и 558 атомов углерода, для них моноизотопные пики будут иметь относительные интенсивности 15% и 0.03% соответственно. Как видно, с увеличением массы относительная интенсивность моноизотопного пика уменьшается, и получить сигнал от него становится трудным. В}

^{этом случае лучше использовать среднюю массу. На рис.4 приведены изотопные распределения и усредненные профили для мелиттина, и цитохрома С, снятые с разными разрешениями.} 

                                                                         ^Рис.4

^{Обычно величина разрешения, необходимого для того, чтобы  получить изотопное распределение в спектре, с перекрыванием изотопных пиков на высоте ~10% от полной высоты, определяется как удвоенное значение m/z, т.е. для разделения изотопов иона с массой 10000 Да необходимо разрешение m/∆m равное 20000. Эта величина, в настоящее время, является предельной для времяпролетных масс-спектрометров.} 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

^{Калибровка.}

^{Калибровка масс-спектрометра –  это важнейший  шаг для определения  молекулярного веса иона неизвестного образца.  Калибровка времяпролетных масс-спектрометров основана на использовании основного уравнения:  , или} 

^{Обычно  для определения  калибровочных постоянных А и В измеряются времена прилета ионов двух стандартных веществ,  массы ионов которых хорошо известны.  Существует два вида калибровки: внутренняя и внешняя.}

^{При внутренней калибровке один или более стандартных веществ смешиваются с неизвестным веществом. Эта смесь затем смешивается с раствором матрицы для МАЛДИ анализа. В идеале стандарты выбираются так, чтобы их массы были выше и ниже массы исследуемого вещества. Один стандарт также может использоваться для калибровки, если он дает в спектре интенсивные пики как от однократно заряженных    ионов,  так и от двукратно заряженных ионов.}

^{При внешней калибровке приготовление стандартов и образца проводится раздельно. Сперва регистрируется масс спектр стандартов, а затем без изменения каких-либо параметров записывается спектр неизвестного вещества.  Очень важно,  чтобы всепараметры эксперимента,  которые могут влиять на изменение времени полета ионов, оставались неизменными.  Константы калибровки вычисляются из спектра стандартов и применяются к неизвестному спектру.} 

^{Казалось бы,  что точность определения  масс для обоих  методов должна быть одинаковой, если все параметры поддерживаются постоянными. Но небольшие отличия в лазерной мощности и в приготовлении образцов могут изменить процесс десорбции и, следовательно, уменьшать точность измерения для внешней калибровки по сравнению с внутренней.  Использование внутренней калибровки тоже имеет свои недостатки. Например,  концентрация внутренних стандартов должна подбираться таким образом, чтобы интенсивности сигналов всех компонентов находились в одном динамическом диапазоне.  Может оказаться необходимым сделать несколько проб с различными концентрациями стандартов.  Также внутренние стандарты могут мешать ионизации исследуемого вещества.  В случае,  когда скорость получения результата и расход}

^{материалов  образца являются критичными предпочтительнее использовать внешнюю калибровку.  В случае,  когда концентрации подобраны правильно и стандарты не подавляют ионизацию исследуемого образца  (и не взаимодействуют с ним),  внутренняя калибровка является более точным методом,  так как исключаются всевозможные флуктуации, связанные с нестабильностью инструмента.}

 

 

 

 

^{Важность  матрицы.}

^{Для того чтобы  десорбировать нелетучую и термонестабильную молекулу неповрежденной, необходимо ввести энергию в систему так, чтобы предотвратить термический распад. Для этих целей идеально подходит лазер, характеризуемый короткими импульсами света высокой интенсивности. До открытия метода МАЛДИ исследуемые образцы напрямую подвергались воздействию лазерным излучением для перевода их в газовую фазу (лазерная десорбция) для масс-спектрометрического анализа. Однако этот метод позволяет исследовать только низкомолекулярные соединения, так как энергия, необходимая для десорбции ионов, приводит и к фрагментации молекул. Введение матрицы в эксперимент позволяет решить эту проблему: Матрица сильно поглощает лазерное излучение на длине волны, на которой исследуемый образец имеет только слабое поглощение; термическая релаксация возбужденных молекул матрицы приводит к испарению матрицы и в то же время переводит нелетучие молекулы образца в газовую фазу без значительного возбуждения и фрагментации. Введение матрицы уменьшает количество межмолекулярных связей кроме связей между молекулами матрицы и образца, так как берется избыток матрицы по сравнению с анализируемым веществом. Что приводит к уменьшению энергии десорбции. Матрица является как источником протонов (регистрация положительных ионов), так и депротонирующим агентом (регистрация отрицательных ионов) в фазе твердого раствора или в газовой фазе и, следовательно, играет важную роль в процессе образования ионов.} 

^{Все эти эффекты  необходимы успешного  применения метода МАЛДИ, и их объединение приводит к большому выходу  неповрежденных ионов молекул образца и увеличению чувствительности метода до субпикомольного диапазона.}  

^{Итак, основные требования к материалу  матрицы  заключаются  в его высокой способности поглощать лазерное излучение; кристаллизоваться с включением в структуру молекул анализируемого вещества; инертности по отношению к анализируемому веществу; хорошей растворимости в растворителях, используемых для растворения образца; низкой летучести в условиях вакуума.} 

^{Чаще всего  в качестве матриц используются твердотельные (в  виде порошков) слабые органические кислоты. Наиболее широкое применение нашли синапиновая кислота (SA) – для исследования пептидов и больших протеинов (10-150 кДа), альфа- циано-4-гидроксикоричная кислота (CHCA) – для пептидов (<10 кДа), лепидов и углеводов и 2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB) – для пептидов, протеинов, углеводов, полимеров и других органических молекул, но также используются и многие другие матрицы. Обычно раствор матрицы в подходящем растворители (концентрация ~ 10 мг/мл) готовится ежедневно, поскольку он светочувствителен и подвержен}

^{фоторазложению, но может храниться короткое время в защищенном от света месте. В качестве растворителей наиболее часто используются вода, этанол, ацетон, ацетонитрил, тетрагидрофуран, хлороформ и т.д. Матрицы в сухом виде более стабильны, но рекомендуется хранить их в темном холодном месте. Если при хранении цвет порошка матрицы изменился, необходимо рекристаллизовать матрицу до ее использования.}

^{Приготовление образцов.}

^{Приготовление образца  является важнейшим  моментом для проведения успешного МАЛДИ анализа. Существует много способов приготовления образца. Наиболее простым и чаще всего успешным остается метод, предложенный Ф.Хилленкампом с М. Карасом в 1988 году. Этот метод получил название метода высушенных капель (dried-droplet метод).}

^{Раствор анализируемого вещества в растворителе, который хорошо смешивается  с растворителем матрицы, добавляется к рабочему раствору матрицы. Молярное соотношение матрица/исследуемое вещество должно составлять от 100 : 1 до 50000 : 1 и оптимизироваться для каждого нового образца. После получения гомогенного раствора, 0.5 – 2 мкл его наносится на специальную мишень из нержавеющей стали и высушивается на воздухе. Во время высушивания происходит кристаллизация матрицы с включением молекул анализируемого вещества в кристаллическую решетку или же молекулы вещества размещаются по поверхности быстро образующихся кристаллов матрицы. Образование и размер кристаллов зависит от природы матрицы и растворителя.}