Контрольная работа по химическим основам технологии пищевых производств

     Влияние этих факторов на активность ферментов  и скорость катализируемых ими реакций  будет рассмотрена в разделе  кинетики.

     Многие  ферменты являются двухкомпонентными, то есть состоят из белковой части - апофермента и связанного с ним  небелкового компонента - кофермента, участвующего в действии фермента в  качестве обязательного кофактора. В результате ферментативных реакций коферменты, как правило, не подвергаются изменениям, однако при ряде последовательно протекающих реакций кофермент может представлять собой субстрат для отдельных ферментов, хотя и регенерируется в конечном счете в исходной форме.

     Единицы активности ферментов. Любой ферментный препарат прежде всего должен быть охарактеризован по его ферментативной активности. Комиссия по ферментам Международного Биохимического Союза рекомендует использовать следующие понятия и выражения единиц активности ферментов.

- Стандартная  единица фермента - это такое количество  фермента, которое катализирует  превращение одного микромоля данного субстрата за одну минуту при заданных условиях. Стандартная единица фермента обозначается буквой E (от русского слова "единица") или буквой U (от английского слова "unit").

- Уд  ельная активность- это число единиц (E или U), отнесенное к одному миллиграмму белка в ферментном препарате. Количество белка в препарате фермента может быть определено любым известным методом определения белка (метод Кьельдаля, метод Лоури и др.).

- Молекулярная  активность - число молекул данного  субстрата или эквивалентов затронутых  групп, превращаемых за одну  минуту одной молекулой фермента  при оптимальной концентрации  субстрата. Это понятие соответствует  числу оборотов, введенных Варбургом. Число оборотов по Варбургу - это число молей превращенного субстрата, приходящееся на моль фермента за минуту. Для определения молекулярной активности фермента нужно знать его молекулярную массу.

- Катал  - каталитическая активность, способная  осуществлять реакцию со скоростью  равной 1 молю в секунду в заданной  системе измерения активности. Каталитическая  активность в 1 катал (кат) при  практическом применении оказывается  слишком большой величиной, по этому в большинстве случаев каталитические активности выражают в микрокаталах (мккат), нанокаталах (нкат) или пикокаталах (пкат). Стандартная единица фермента находится с каталом в следующем соотношении: 1 E (U) = 16,67 нкат. Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции.                    .       Концентрация субстрата является важнейшим фактором, определяющим скорость ферментативной реакции.

 Еще  в 1902г. В. Анри при изучении  реакции ферментативного гидролиза  сахарозы предположил, что фермент  р-фруктофуранозидаза взаимодействует со своим субстратом, затем это соединение распадается, фермент остается в первоначальном виде, а субстрат сахароза оказывается расщепленной на глюкозу и фруктозу. Это предложение было в дальнейшем развито Л. Михаэлисом и M. Ментен. В 1913 г. они постулировали следующие уравнения ферментативной реакции:

где k+1- константа скорости реакции образования  комплекса ES, k-1 k+2 - константы скорости реакции распада комплекса ES в  двух направлениях.

Тогда Ks- константа диссоциации комплекса ES равна отношению констант скоростей обратной и прямой реакции:

Ks= k-1k+1

Исходя  из закона действующих масс, можно  записать следующее уравнение:

[S] •([E0] -[ES]) = Ks •[ES],

где [E0] - концентрация фермента в начале ферментативной реакции, [S] - концентрация субстрата, (ES] - концентрация комплекса "фермент-субстрат", [E0]-[ES] - концентрация фермента, не связанного в комплексе с субстратом.

В ходе ферментативной реакции в любой  момент времени фермент существует в двух формах: свободной и связанной, т. е. в форме комплекса ES.

     Скорость  ферментативной реакции будет максимальной при такой концентрации субстрата, когда весь фермент перейдет в  комплекс ES, т.е. когда все активные центры насыщены субстратом и дальнейшее увеличение концентрации субстрата  не приведет к увеличению скорости реакции.

Преобразуя  представленное выше уравнение, получим  выражение, которое будет иметь  следующий вид:

V0= Vmax[S]K s+[S] 

     Это уравнение названо уравнением Михаэлиса-Ментен. Оно имеет огромное значение для выражения зависимости действия ферментов от концентрации субстрата. Однако оно содержит и ряд недостатков, в частности, при его выводе было сделано несколько допущений, например, не учитывалась вторая стадия ферментативной реакции - образование E и P.

В связи  с этим был предложен рад усовершенствованных  уравнений, с учетом влияния образовавшихся продуктов реакции. В настоящее  время наиболее широко используют уравнение  Холдейна-Бриггса. Оно имеет следующий вид:

V0= Vmax[S]K m+[S] 

В этом уравнении вместо K s - константы диссоциации  комплекса ES, который присутствует в уравнении Михаэлиса-Ментен, стоит Km-константа Михаэлиса (в числителе которой находятся константы скоростей реакций, ведущих к распаду комплекса ES в двух направлениях):

Km= k-1+K+2K +1

Поскольку K s = k-1 k+1

 то Km = Ks+ k+2k+1

  то есть Km всегда больше Ks.

Для того, чтобы графическая зависимость, выражающая влияние концентрации субстрата на начальную скорость ферментативной реакции, из гиперболической преобразовалась в прямолинейную, что, очевидно, представляет большее удобство в экспериментальной практике, уравнение Холдейна-Бриггса было преобразовано Лайнуивером и Берком по методу двойных обратных величин.

1V0 = K mVmax  • 1[S]   + 1Vmax

 

Величина  Km - это ключевой кинетический параметр; если [S] = K m, то V= Vmax/2, следовательно, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (в молях на литр), при которой скорость реакции равна половине максимальной.

     Приблизительное значение Km можно получить простым графическим способом, как это показано на рис. 8.4 а; однако в этом способе достаточно велика погрешность в нахождении Vmax. Значительно удобнее пользоваться прямолинейной зависимостью при обработке данных по методу двойных обратных величин. В этом случае можно получить более точное значение Km.

     Источником  множества недоразумений как в прошлом, так и в настоящем, является некорректное использование термина "константа Михаэлиса" и двух символов Ks и Km для обозначения величин отнюдь неидентичных, несмотря на совершенно четкие рекомендации Комиссии по ферментам Международного Биохимического Союза. Первая величина -Ks- константа равновесия, выражаемая отношением Ks = k-1k+1

характеризует сродство фермента к субстрату (или, иначе, прочность комплекса ES), причем существует обратная пропорциональность между величиной Ks и сродством фермента к субстрату. Вторая величина -Km-соответствует концентрации субстрата, при которой V= Vmax/ 2. Часто свойство Ks ошибочно приписывают Km. Ha самом деле Km будет являться мерой сродства фермента к субстрату только в том единственном случае, когда величина k+2 будет настолько мала, что Km практически совпадет с Ks.

     Многие  ферменты катализируют реакции с  участием двух субстратов. К так  называемым бимолекулярным реакциям относятся  реакции переноса химических группировок  с одного соединения на другое, реакции  синтеза, окислительно-восстановительные реакции.

     Такие реакции могут протекать по двум различным механизмам. В реакциях первого типа, называемых реакциями  единичного замещения, два субстрата А и В образуют с ферментом комплекс EAB, который затем распадается с образованием продуктов реакции С и Д. Второй тип двухсубстратных реакций протекает по механизму двойного замещения (механизм типа "пинг-понг"). В этих реакциях с активным центром фермента в каждый момент времени связан только один из двух субстратов.

При исследовании кинетики бимолекулярных реакций концентрацию одного из субстратов оставляют постоянной (В), а второго - изменяют (А). В этом случае в координатах 1/V от 1/[A] можно  получить "кажущееся" значение К т. Истинное значение Vmax и К Bmполучают при исследовании нескольких концентраций субстрата В. Точно так же поступают при определении K Am(когда концентрация А постоянна, а концентрация В варьируется). Кт по отношению к различным субстратам в одной и той же реакции могут быть различными.

     Влияние концентрации фермента на скорость ферментативной реакции.

     Концентрация  фермента оказывает существенное влияние  на скорость ферментативной реакции. При  насыщающей концентрации субстрата, обеспечивающей Vmax, начальная скорость ферментативной реакции будет, в первую очередь, зависеть от концентрации фермента. Эта зависимость прямо пропорциональная, что свидетельствует о том, что начальная скорость является мерой количества фермента.

     Влияние температуры на активность ферментов. Общий вид кривой, характеризующей  влияние температуры на активность фермента, можно представить в  виде графика, изображенного на рис. 8.6.

Оптимальная температура, при которой наблюдается  максимальная активность, для большинства  ферментов находится в пределах 37-50 0C, но некоторые ферменты имеют  температурный оптимум за пределами этой зоны.

     Влияние температуры на активность фермента, которое может быть легко изучено  экспериментально, имеет очень сложный  характер, так как обусловлено  целым рядом факторов, а именно:

- влиянием  температуры на скорость расщепления  комплекса ES на свободный фермент  и продукт реакции, т. е. на  константу скорости реакции 

- влиянием  температуры на сродство фермента  к субстрату, то есть на константы  k+1 и k_,;

- влиянием  на теплоту ионизации, а, следовательно,  на процессы ионизации всех  компонентов реакции: самого фермента, субстрата, промежуточных и конечных  продуктов реакции; 

- влиянием  на образование таких соединений, как "фермент-активатор" или  "фермент-ингибитор";

- влиянием  на процесс денатурации ферментного  белка. 

     Изменение скорости ферментативной реакции при  повышении температуры измеряется температурным коэффициентом Q10, который  показывает, во сколько раз ускоряется данная реакция при повышении  температуры на десять градусов. Можно  преобразовать уравнение Аррениуса, подставив в него коэффициент Q10:

E = RT2InQ10

     Это уравнение дает возможность определить энергию активации путем определения  значений Q10 для данной ферментативной реакции.

Для обычных  химических реакций Q10= 2-3, для ферментативных реакций (левая часть температурной  кривой) Q10= 1-2, причем значение Q10= 1 характерно для температур, близких к оптимальным.

Правая  часть температурной кривой показывает резкое снижение скорости ферментативной реакции при температурах, превышающих  оптимальную. И это зависит, в первую очередь, от денатурации ферментного белка. Поэтому очень важным показателем, характеризующим отношение фермента к температуре, является его термостабильность.

Термостабильность фермента складывается как бы из двух критериев: величины температуры и времени ее воздействия на фермент. Кроме того, на термостабильность различных ферментов могут оказывать влияние и такие факторы, как рН среды, ее солевой состав, защитное действие субстрата.

Влияние рН на активность ферментов. Для каждого  фермента характерна определенная узкая  область значений рН, при которой  он проявляет максимальную активность.

Форма кривых, описывающих зависимость  активности фермента от рН, отражает способность  важных для данного фермента протон-донорных или протон-акцепторных групп в активном центре фермента переходить в состояние с требуемой степенью ионизации при определенных значениях рН 

     Кроме влияния рН на состояние ионизации  активного центра фермента, ход представленных кривых будет зависеть и от других факторов. В частности, изменение  рН среды изменяет состояние ионизации  субстрата (если это заряженное вещество), комплексов ES и EP, в некоторых, например, окислительно-восстановительных реакциях, ионы H+ сами могут принимать участие в реакции; помимо этого, скорость денатурации ферментативного белка зависит от рН.