Методы определения массовой доли азотистых веществ в пищевых продуктах

Лабораторна робота № 3

Тема: Методи визначення масової частки азотистих речовин

в харчових продуктах

Харчова цінність продуктів значною мірою залежить від вмісту в них азотистих  речовин, в основному, білків. Їх основне  значення полягає в незамінності іншими компонентами їжі. Білки складають основу процесів життєдіяльності організму. Необхідність їх постійного оновлення лежить в основі обміну речовин. Вміст вільних амінокислот та інших форм азоту – результат ферментативних процесів, що проходять під час зберігання або перероблення продуктів.

Білки в організмі  виконують структурну (побудова тканин та клітинних компонентів) та функціональну (ферменти, гормони, дихальні пігменти) роль.

Дефіцит білка в харчовому раціоні підвищує сприйнятливість організму до інфекційних захворювань, порушує процеси кровотворення, обмін ліпідів, вітамінів та ін. У дітей у разі білкової недостатності уповільнюється ріст та розумовий розвиток.

Тривалий надлишок білка в харчуванні також негативно впливає на життєдіяльність організму, викликаючи перезбудження нервової системи, порушення обмінних процесів, перевантаження печінки та нирок.

В щоденному  раціоні дорослої людини білки повинні  складати приблизно 14 % загальної калорійності, поєднуючись в певному співвідношенні з іншими харчовими речовинами.

Рослинні білки  засвоюються організмом не повністю порівняно з тваринними. Так, білки  молока та яєць засвоюються на 96 %, білки  риби та м'яса – на 95 %, білки хліба  з борошна пшеничного І та ІІ сортів – на 85 %, білки картоплі, хліба  з обойного борошна, бобових – на 70 %. Враховуючи, що рослинні білки менш повноцінні за складом незамінних амінокислот, ніж тваринні, споживання певної кількості тваринних білків  цілком необхідне. Для дорослої людини частка тваринних білків в середньому повинна складати 55 % загальної кількості білка в раціоні.

Масову частку білка в харчових продуктах визначають за кількістю загального азоту методом  К’єльдаля. Він дає точні результати, але дуже трудомісткий та тривалий. З розвитком фото- та спектрофотометрії були розроблені методи кількісного визначення білка, які базуються на його здатності утворювати забарвлені сполуки з деякими реагентами. Серед них слід виділити метод Лоурі, біуретовий метод. Знаходять застосування також фізико-хімічні методи, в основу яких покладено специфічні властивості білків: утворення різних ступенів помутніння в залежності від концентрації білка в розчині сульфосаліцилової кислоти (нефелометричний метод), здатність білка адсорбувати деякі барвники та інші властивості білка.

Всі перераховані методи можуть бути віднесені до прискорених. За відносно невеликих затратах часу вони характеризуються достатньо високою точністю, простотою та швидкістю визначення.

 

Порядок виконання роботи

РОБОТА 1. ВИЗНАЧЕННЯ МАСОВОЇ ЧАСТКИ ЗАГАЛЬНОГО АЗОТУ  В ХАРЧОВИХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ К’ЄЛЬДАЛЯ (теоретично)

Метод базується  на мінералізації наважки продукту під час нагрівання з концентрованою сірчаною кислотою в присутності  каталізаторів. При цьому вуглець  та водень органічних сполук окислюються  до діоксиду вуглецю та води, азот, що вивільняється у вигляді аміаку, з’єднується в колбі з сірчаною кислотою, утворюючи сульфат амонію. Схематично реакції можуть бути представлені таким чином:

RCHNH₂COOH + H₂SO₄ → CO₂ + SO₂ + H₂O + NH₃;

2 NH₃ + H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄.

На наступних стадіях дистиляції розчин сульфату амонію обробляють концентрованим розчином гідроксиду натрію, при цьому аміак вивільняється та вловлюється титрованим розчином сірчаної кислоти. Надлишок сірчаної кислоти титрують розчином гідроксиду натрію. Метод К’єльдаля застосовують в кількох модифікаціях, які відрізняються в основному умовами мінералізації. Для прискорення процесу вводять різні каталізатори: оксид міді, селен, свинець та інші, підвищують температуру кипіння сірчаної кислоти додаванням солей, сульфату калію або натрію, поєднують додавання каталізатора та солей під час спалювання наважки.

Методом К’єльдаля в будь-якій модифікації визначається кількість загального азоту. Масова частка білка розраховується множенням отриманої величини загального азоту на коефіцієнт 6,25, виходячи з того, що в білках у середньому міститься 16 % азоту. Умовність отриманих результатів у разі такого перерахунку очевидна, оскільки не весь азот харчового продукту знаходиться у формі білка і, крім того, відсотковий вміст азоту в білках коливається як в сторону збільшення, так і в сторону зниження від 16 %. В деяких продуктах азотисті речовини небілкового характеру досягають значної кількості (м’язова тканина риби – 15 %, м'ясо тварин – 10…16 % від загальної кількості азотистих речовин).

Для отримання  більш точних результатів необхідно  або під час перерахунку загального азоту на білок використовувати  різні коефіцієнти залежно від  відсоткового співвідношення азоту  в білках окремих продуктів: м'ясо  та овочі – 6,25; пшениця, жито, горох та ін. – 5,7; гречка, рис – 6,0; молоко – 6,37 і т.д., або білковий азот визначати окремо спеціальними методами.

Наважка для  аналізу повинна містити 20…40 мг азоту. Сипкий матеріал (зерно, солод) попередньо подрібнюють так, щоб помел проходив через сито з комірками розміром 0,8 мм.

При аналізі  борошна наважку біля 1 г відбирають в суху пробірку та підвішують її за допомогою кільця з дроту до крючка  над чашею аналітичних вагів. Пробірку з борошном зважують з точністю до ±0,0002 г. Потім борошно пересипають в колбу К’єльдаля, для чого колбі надають горизонтальне положення, вводять в її горло якомога глибше пробірку і, придержуючи пробірку, ставлять колбу вертикально, слідкуючи, щоб частинки борошна не потрапили на стінки горла. Порожню пробірку зважують та по різниці двох зважувань знаходять величину наважки. Аналіз проводять в двох паралельних пробах та водночас беруть дві наважки для визначення масової частки вологи.

При аналізі  рідких продуктів пробу відбирають піпеткою в такому об’ємі, який містив би 20…40 мг азоту. Піпетку з пробою опускають на дно колби К’єльдаля та переводять в колбу пробу рідини. Рідину підкислюють кількома краплями концентрованої сірчаної кислоти та випарюють спочатку на малому вогні газового пальника, а потім на водяній бані до сиропоподібного стану. Під час випарювання не можна допускати підгоряння та обвуглювання рідини на стінках колби.

Для спалювання  відміряють циліндром 10 см³ концентрованої сірчаної кислоти, невеликою її кількістю повністю змочують наважку (або випарену колбу), потім кислотою, що залишилася, обмивають стінки колби, додають 0,5…1 г каталізатора, колбу закривають спеціальною насадкою або скляною воронкою діаметром 3…4 см та під нахилом встановлюють у витяжній шафі на сітці над пальником. Гази, що виділяються під час згорання, сильно спінюють масу і на початку спалювання нагрівання регулюють так, щоб маса не піднімалася в горло колби та не відбувався її викид. Коли спучування закінчиться і маса стане рідкою, нагрівання підсилюють та під час слабкого кипіння закінчують озолення до повного освітлення розчину. Під час озолення треба слідкувати за тим, щоб сильно не нагрівалося горло колби, на якому повинні конденсуватися пари сірчаної кислоти, бо відбудеться швидке випарювання кислоти та можливий частковий розклад сульфату амонію.

В процесі озолення  колбу періодично струшують  та перегортають так, щоб кислота і конденсат  парів кислоти, що стікають, послідовно омивали всю внутрішню поверхню колби, не залишаючи на ній обвуглених частинок. Після того як розчин набуде синьо-зелений без бурого відтінку колір, кип’ятіння продовжують ще 10…15 хв. Потім нагрівання припиняють і колбі дають охолодитися. Під час згорання дверцята витяжної шафи повинні бути закритими, повинно бути забезпечено повне видалення отруйних газів.

В охолоджену колбу по стінці невеликими порціями під час перемішування приливають 30 см³ дистильованої води та приступають до відгонки аміаку на стандартній установці (рис. 3.1). В якості пароутворювача можна брати колбу на 2 дм³. В пробку цієї колби вставляють запобіжник у вигляді скляної трубки довжиною біля 1 м та діаметром 5…6 мм. Кінець трубки не доходить до дна колби на 3…5 см. Для регулювання кипіння між пароутворювачем та воронкою для лугу вставляють трійник, на вільний кінець якого надягають гумову трубку з винтовим зажимом. Кінець трубки  опускають в склянку, де збирається конденсат. Відгонка аміаку за допомогою пари з тієї ж колби, в якій відбувалось згорання аналізованої проби, виключає можливість втрат аміаку.

 

 

 

Рис. 3.1. Установка для відгонки аміаку

1 – пароутворювач; 2 – воронка; 

3, 4 – зажими; 5 – колба К’єльдаля; 6 – холодильник; 7 – конічна колба; 8 – кран; 9 – воронка для лугу;

10 - краплевловлювач 

 

та кран, а  інший зажим 4 закривають; відставляють конічну колбу з-під холодильника. В іншу конічну колбу на 150…250 см³ з бюретки відміряють      25 см³ 0,1 моль/дм³ розчину сірчаної кислоти (або 25 см³ 2 %-го розчину борної кислоти), додають 3…4 краплі індикатора та підставляють її під холодильник так, щоб кінець його трубки був занурений у розчин кислоти. Замість запасної колби К’єльдаля на пробку надягають колбу К’єльдаля, в якій відбувалося згорання. Кран 8 закривають і у воронку 9 наливають 35…40 см³ 33 %-го розчину лугу, після чого невеликими порціями спускають його в колбу, обережно перемішуючи вміст колби похитуванням. Потім кран 8 закривають, відкривають зажим 4, закривають зажим 3 та пропускають пару через рідину в колбі К’єльдаля. Кипіння не повинно бути бурхливим, щоб краплі лугу не потрапляли в краплевловлювач.

Через 15…20 хв від  початку перегонки аміаку приймальну колбу опускають так, щоб кінець холодильника був вище рівня рідини в колбі, та продовжують перегонку ще 5…10 хв. Швидкість перегонки регулюють за допомогою нагріву або зажимом так, щоб до кінця перегонки об’єм рідини в колбі збільшився вдвічі. По закінченню перегонки відкривають зажим 3 та кран 8, а інший зажим 4 закривають. Кінець холодильника з промивалки обмивають водою, не виймаючи з колби, та титрують надлишок Н₂SO₄ 0,1 моль/дм³ розчином NaOH до появи зеленого кольору.

Вміст азоту  Х, % до СР, розраховують

                                                        

        де  – кількість 0,1 моль/дм³ Н₂SO₄, взята в приймальну колбу для відгонки, см³;

  - кількість 0,1 моль/дм³ NaOH, що пішла на титрування надлишку кислоти, см³;

- маса пробірки з наважкою, г;

-  маса порожньої пробірки (після висипання зразка в колбу  К’єльдаля), г;

– масова частка вологи в  зразку, %.

У разі використання Н₂ВO₃ перегонка аміаку ведеться так само, але вміст приймальної колби титрують 0,1 моль/дм³ розчином Н₂SO₄ до переходу зеленого забарвлення в червоно-фіолетове (в формулі немає).

Результати аналізу  виражають з точністю до 0,01 %, а  розходження між двома паралельними дослідами не повинно перевищувати ±0,3 %.

В лабораторній практиці для відгонки аміаку використовують також спрощений прилад. Тоді у  відгінну колбу вносять шамот, щоб  не пінився розчин.

Для перерахунку  кількості азоту на СР визначають масову частку вологи експресним методом.

Кількість азоту перераховують  на білок множенням отриманої  величини на коефіцієнт 6,25, порівнюють з очікуваним вмістом білка в  продукті, встановлюють причини відхилення та його величину.

 

РОБОТА 2. ВИЗНАЧЕННЯ МАСОВОЇ ЧАСТКИ БІЛКОВИХ РЕЧОВИН В ХАРЧОВИХ ПРОДУКТАХ БІУРЕТОВИМ МЕТОДОМ

Специфічною реакцією на вміст білка є біуретова  реакція, оскільки її дають поліпептидні зв’язки. Вона отримала свою назву  від похідного   сечовини –  біурета, який утворює в лужному  розчині мідного купоросу забарвлену комплексну сполуку. Інтенсивність забарвлення пропорційна вмісту пептидних зв’язків, а отже, і концентрації білка в розчині.

Біуретову реакцію дають  всі білки, пептони та поліпептиди, починаючи з тетрапептидів.

Ця реакція тривалий час використовувалася як якісна реакція на білок.  Далі вона стала застосовуватися для кількісного визначення білка в різних об’єктах. Біуретовий метод використовують в різних модифікаціях, які відрізняються умовами екстрагування білка, способами внесення біуретового реактиву та технікою колориметрування.

Нижче наведено біуретовий метод  визначення масової частки білка  в харчових продуктах модифікації  Дженнінгса, експериментальна перевірка  якого виявила ряд його переваг  перед іншим модифікаціями.

 

За величиною оптичної густини білкової витяжки визначають вміст білка в наважці (мг) за допомогою калібрувальної кривої (рис. 3.2).

Розраховують масову частку білка у % на сухі речовини:

                                                       

де  - кількість білка у взятій наважці, мг;

- маса наважки харчового  продукту, г;

- масова частка вологи  в продукті, %.

Рис. 3.2. Калібрувальна  крива для 

визначення масової  частки білка 

біуретовим методом

Потім приведеним вище методом Дженнінгаса визначають оптичну густину білкових витяжок всіх зразків.

При побудові кривої на осі абсцис відкладають величини оптичної густини, а на осі ординат  – вміст білка в наважці  в мг.

Для перерахунку  вмісту білка на СР продукту слід визначити масову частку вологи в ньому експресним методом. Дані оформлюють у вигляді таблиці (табл. 3.1).