Группа пневмовирусов

      5. Клетки инкубируют 3-5 сут. при 31-39°С; время инкубации зависит от температуры: чем выше температура, тем короче время инкубации.

      Для приготовления стабильных препаратов, в которых можно подсчитывать бляшки через длительное время после  опыта, в каждую чашку добавляют 2 мл 1%-ного раствора глутарового альдегида в PBS и оставляют при комнатной температуре по крайней мере на 4 ч для фиксации. Фиксирующий раствор и агаровое покрытие удаляют и добавляют в чашки раствор подходящего красителя, окрашивают в течение 5 мин, затем тщательно промывают водой и сушат. Для максимально точного подсчета бляшек необходим бинокулярный микроскоп с небольшим увеличением. Для окрашивания можно использовать и 0,01%-ный раствор нейтрального красного в PBS или в среде, содержащей 0,9% агара.

      Обычно  для усиления контраста из состава  агарового покрытия исключают феноловый  красный, но это не имеет принципиального  значения. Окрашивание раствором  нейтрального красного проходит быстрее, однако такие препараты нестабильны  и подвержены фотохимическому повреждению под действием света.

      Окрашивание с помощью твердого нейтрального красного, входящего в состав агарового  покрытия, происходит медленнее, однако в тех случаях, когда необходимо выделить инфекционный вирус из индивидуальных бляшек, данный метод явно предпочтительнее.

2.3 Гемагглютинация

 

      В культуральной жидкости инфицированных РСВ клеток гемагглютинин не обнаруживается. Гемагглютинация с эритроцитами человека, африканской зеленой мартышки, макаки-резуса, морской свинки, крысы, хомячка, мыши, гуся, овцы, свиньи, курицы и цыпленка не отмечена.

      С другой стороны, ВПМ агглютинирует  эритроциты мыши и хомячка. Методические аспекты постановки реакции гемаглютинации описаны в работе Компанса и др.

2.4 Гемадсорбция

 

      Адсорбция эритроцитов на клетках, зараженных РСВ, не описана. Негативные результаты получены с эритроцитами африканской зеленой мартышки, шимпанзе, обезьяны гелады, морской свинки, крысы, хомячка, мыши, утки, гуся, голубя, курицы и цыпленка. Однако клетки, зараженные ВПМ, связывают эритроциты мыши; технические детали описаны Ком-пансом и др. .

2.5 Иммунофлуоресцентные методы

 

      Иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью поликлональной антисыворотки представляет собой удобный и точный метод подсчета зараженных клеток и выявления места размножения вируса при анализе фиксированных срезов зараженных тканей. Используя моноклональные антитела против индивидуальных вирусных полипептидов, иммунофлуоресцентным методом можно изучать и внутриклеточную локализацию вирусных антигенов.

      Иммунофлуоресцентное  окрашивание применяется также для быстрой диагностики вирусных инфекций. Это направление недавно рассмотрено в исчерпывающих обзорах, а конкретные методы обнаружения РСВ в клиническом материале описаны в работе Гарднера и др. Иммунофлуоресценция - более точный метод выявления РСВ в организме больного, чем непосредственное выделение вируса, поскольку в период реконвалесценции после вызванного РСВ заболевания зараженные клетки бывают покрыты противовирусными антителами.

      Непрямая  иммунофлуоресценция более чувствительна, чем прямая, однако при ее использовании возникает проблема неспецифической флуоресценции. Ее можно устранить предварительным истощением антисыворотки и антииммуноглобулинового конъюгата обработанной ацетоном культурой клеток или гомогенатом печени животных. Обработка клеток ацетоном проводится следующим образом:

      1. 10^s-10⁹ клеток снимают со стекла и получают суспензию.

      2. Клетки концентрируют центрифугированием и ресуспендируют в 0,01 М PBS; эту процедуру повторяют трижды.

      3. Осадок клеток ресуспендируют_: 5 мин в 10-кратном объеме ацетона и вновь осаждают клетки.

      4. Клетки ресуспендируют в 0,01 М  PBS и проводят 6 циклов осаждения для полного удаления ацетона. После этого клетки можно хранить до употребления в 0,01 М PBS при - 20 °С.

      Ниже  приведена стандартная методика для выявления антигенов РСВ в зараженных клетках методом непрямой иммунофлуоресценции.

      1. В пластиковые чашки диаметром  50 мм помещают тщательно вымытые  и дегидратированные этанолом  покровные стекла и высевают  по ЫО⁶ клеток BS-C-1. Инкубируют клетки 24 ч, промывают и заражают РСВ с множественностью инфекции около 1 БОЕ/кл.

      2. После адсорбции вируса в течение  2 ч покровные стекла с зараженными  клетками тщательно промывают  средой MEM, содержащей 2,5% ЭТС, и инкубируют при 31 или 39 °С.

      3. Через 40-48 ч после заражения клетки фиксируют на 5 мин в охлажденном до 4°С ацетоне, высушивают на воздухе 30 мин и хранят при - 20 °С.

      4. Антивирусную сыворотку истощают  обработанными ацетоном клетками  BS-C-1 при 4°С и используют в подобранном оптимальном разведении. Кроличья сыворотка против глобулинов нескольких видов животных, конъюгированная с изотиоцианатом флуоресцеина, имеется в продаже. Конъюгат истощают обработанным ацетоном гомогенатом печени мыши или клетками BS-C-1 при 4°С.

      5. Покровные стекла инкубируют с антивирусной сывороткой 1 ч при 37 °С, промывают и инкубируют еще 45 мин при 37 °С с соответствующим конъюгатом.

      6. После промывки препараты заключают  в забуференный глицерин и  исследуют под флуоресцентным  микроскопом. Рис.3 иллюстрирует разрешение, которое может быть получено при использовании данного метода.

      Доказательствами  специфичности иммунофлуоресценции  могут служить:

      1) отсутствие флуоресценции незараженных клеток BS-C-1;

      2) отсутствие флуоресценции при использовании ЭТС вместо специфической с зараженными РСВ клетками;

      3) отсутствие флуоресценции после истощения противовирусной сыворотки зараженными клетками.

      Высокой чувствительностью обладает и иммунопероксидазный метод; его преимущество состоит в том, что он не требует использования микроскопа с ультрафиолетовой оптикой.

2.6 Твердофазный иммуноферментный анализ

 

      ELISA - еще один иммунологический метод быстрого обнаружения и количественного определения РСВ. Ниже приведена типичная методика.

      1. Лунки планшета для иммунологических  реакций покрывают зараженными или незараженными клетками, или РСВ, очищенным центрифугированием в градиенте. Это делается одним из следующих методов:

      а) клетки выращивают в лунках планшета и через ряд заражают РСВ. Когда  в лунках с зараженными клетками проявляется ЦПД, клетки промывают, фиксируют раствором, содержащим этанол и уксусную кислоту, и хранят при - 20 °С;

      б) в лунки планшета вносят РСВ, очищенный  центрифугированием в градиенте, и  высушивают в течение ночи при 37°С. 

        

      Если  имеются клетки, персистентно инфицированные РСВ, их можно использовать в качестве источника антигена вместо литически инфицированных клеток.

      2. Перед началом анализа все  лунки планшета покрывают 5% -ным раствором БСА в PBS. В каждый опыт следует включать негативный контроль и позитивный контроль. В лунки планшета вносят образцы вируса и инкубируют в течение ночи при 4°С. Планшет промывают и добавляют овечьи антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена в рекомендуемом разведении. Планшет инкубируют 1 ч при 37 °С, промывают, добавляют субстрат, о-фенилендиамин, и инкубируют при 37 °С еще 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 4,5 М H2SO4 и учитывают результаты с помощью ридера "Мультискан".

      Хиерхольцер и др. описали методику, позволяющую  с помощью ELISA количественно выявлять белковые полосы после электрофореза и переноса белков на нитроцеллюлозные мембраны, так называемый метод "вестерн-блотинга". Преимущество этого метода состоит в том, что он не требует использования радиоактивных изотопов.

 

3. Аналитические методы

3.1 Радиоактивное лечение, радиоиммуноанализ и радиоиммунопреципитация

3.1.1 Введение радиоактивной метки в вирусные белки в зараженных РСВ клетках

      1. Оптимальные условия для мечения  вирусных белков достигаются  при добавлении к зараженным  клеткам через 18 ч после заражения актиномицина D в концентрации 2,5 мкг/мл.

      Белки РСВ удается эффективно пометить смесью - Meтионина и - цистеина по следующей методике.

      2. Через 2 ч после внесения актиномицина  D культур ал ьную среду заменяют на среду, содержащую 50 мкКи/мл L--Meтионина и 25 мкКи/мл Ь--цистеина. у

      3. Клетки инкубируют 16 ч при 37 °С  или до проявления выраженного  ЦПД.

      4. Монослой промывают, солюбилизируют  клетки и экстрагируют белки  лизирующим буфером.

      5. После инкубации в течение  2 ч при комнатной температуре лизат используют для электрофореза или хранят при - 20 °С.

      Рис.4 иллюстрирует результаты разделения меченных - метионином белков РСВ в пластине 10% -ного полиакриламидного геля. Вирусные гликопротеины можно пометить аналогичным методом, используя в качестве метки 50 мкКи/мл - глюкозамина или - маннозы. Альтернативный метод введения метки в гликопротеины оболочки РСВ заключается в йодировании поверхности зараженных вирусом клеток лактопероксидазным методом. Белки очищенного нуклеокапсида РСВ можно йодировать с помощью хлорамина Т.

 

      

3.1.2 Радиоиммуноанализ

      Метод прямого RIA с использованием в качестве вторых антител меченных ¹²⁵1 гамма-глобулинов сыворотки козы против глобулинов мыши, а в качестве субстрата - фиксированных метанолом персистентно инфицированных РСВ клеток описан Коутом и др. .

3.1.3 Радиоиммунопреципитация

      Радиоиммунопреципитация проводится стандартным методом, описанным, например, Ферни и Герином и Уордом и др. Для РСВ применяют следующую методику.

      1. "Монослойные культуры клеток в чашках Петри диаметром 50 мм заражают РСВ с множественностью инфекции более 1 БОЕ/кл. Через определенные промежутки времени после заражения проводят импульсное мечение. Для этого культуральную среду в чашках заменяют на 1 мл PBS, содержащего 30 мкКи - метионина и 25 мкКи - цистеина, и инкубируют чашки при 31 °С 1 ч.

      2. Радиоактивный раствор сливают  и монослой промывают охлажденным  PBS.

      3. Клетки снимают со стекла с  помощью стерильной резиновой  палочки и осаждают центрифугированием.

      4. Клетки ресуспендируют в 200 мкл лизирующего буфера, инкубируют суспензию 30 мин в ледяной бане, затем интенсивно перемешивают.

      5. Ядра и клеточный дебрис удаляют  центрифугированием 5 мин при 10 000 g.

      6. Лизат осветляют инкубацией с  50 мкл 10% -ной суспензии фиксированных формалином стафилококков или с 50 мкл суспензии покрытых белком-А гранул 30 мин при 0°С.

      7. Стафилококки удаляют центрифугированием. К 50 мкл лизата добавляют 10 мкл гипериммунной сыворотки,  перемешивают и инкубируют 3 ч  во льду.

      8. Добавляют 100 мкл суспензии стафилококков, перемешивают и инкубируют смесь 30 мин при комнатной температуре.

      9. Иммунные комплексы осаждают  центрифугированием 20 с при 10 000 g.

      10. Осадок 3 раза промывают раствором,  содержащим 500 мМ LiCl, 100 мМ трис-HCl, рН 8,5.

      11. Осадок после промывки ресуспендируют в 50 мкл смеыг для диссоциации, кипятят 2 мин и либо немедленно наносят на гель для электрофореза, либо хранят при - 20 °С.

 

3.2 Метод выявления дефектных интерферирующих частиц

 

      Дефектные интерферирующие частицы и стандартные вирионы РСВ не удается разделить физическими методами, на проявление устойчивой к ультрафиолетовому облучению и чувствительной к нейтрализующим антителам интерферирующей активности при пассировании вируса с высокой множественностью инфекции свидетельствует о накоплении ДИЧ. Разра-Зотзн колориметрический метод количественного определения ДИЧ в препаратах РСВ. Он основан на измерении интенсивности окрашивания, обусловленного поглощением нейтрального красного клетками, которые выживают при заражении стандартным вирусом в результате защиты ДИЧ. Приводятся данные о том, что колориметрический метод чувствительнее, чем метод, основанный на определении снижения выхода вируса. Колориметрический анализ проводят следующим образом.