Группа пневмовирусов

      1. Монослойные культуры клеток  Нер-2, выращенные в лунках планшета  диаметром 16 мм, инкубируют с содержащим  ДИЧ материалом 2 ч при 37 °С.

      2. Содержащий ДИЧ иннокулят удаляют и заражают клетки стандартным вирусом, полученным в результате пассирования с низкой множественностью, и продолжают адсорбцию 2 ч при 37 °С.

      3. В каждую лунку вносят по 1 мл  культуральной среды и инкубируют  клетки 72 ч при 37 °С.

      4. Среду удаляют и вносят в  каждую лунку по 0,5 мл нейтрального  красного в растворе Эрла; инкубацию клеток продолжают еще 2 ч при 37 °С.

      5. Краситель удаляют и клетки  дважды промывают PBS.

      6. Краситель экстрагируют из клеток 1 мл 50% -ного этанола, содержащим 0,1 М NaH2P0₄, и определяют его количество спектрофотометрически при 540 нм. Полученные данные сравнивают с количеством красителя, экстрагированного из незараженных клеток и из клеток, зараженных стандартным вирусом.

      Концентрацию  ДИЧ можно рассчитать следующим  образом, предполагая, что их распределение  по клеткам подчиняется закону Пуассона:

      число ДИЧ/мл= 1/разведение, обеспечивающее выживание 63% клеток Х общее число клеток X 1/объем иннокулята.

3.3 Электронная микроскопия

 

      Пневмовирусы  исключительно многообразны по форме; кроме того, их вирионы и нуклеокапсиды  нестабильны и легко повреждаются при обычных процедурах концентрирования вирусов. Поэтому точный подсчет вирусных частиц практически невозможен.

      Трансмиссионная электронная микроскопия удобна для идентификации вирусов и  изучения морфологии и морфогенеза  ви-рионов. Сканирующая электронная микроскопия используется для изучения морфологии поверхности зараженных клеток, а также для количественного определения поверхностных антигенов на основе специфического связывания бактериальных клеток.

3.3.1 Морфология вирионов

      Для негативного контрастирования успешно применяют следующие вещества: фосфорно-вольфрамовая кислота, фосфовольфрамат натрия, фосфовольфрамат калия, кремневольфрамат натрия и уранилацетат. Концентрирование вируса необходимо проводить самым мягким методом, например осаждением полиэтиленгликолем или ультрафильтрацией через фильтры "Амикон", избегая высокоскоростного центрифугирования. Каплю концентрированного раствора вируса наносят на покрытую графитом формваровую сеточку. Для фиксации добавляют равный объем 3% -ного глутарового альдегида в PBS, перемешивают и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Сеточки промывают PBS и проводят негативное контрастирование. Для визуализации нуклеокапсидов зараженные клетки лизируют дистиллированной водой или гипотоническим буферным раствором. Клеточный дебрис можно осадить непосредственно на сеточке перед негативным контрастированием.

3.3.2 Морфогенез вирионов

      1. Зараженные клетки фиксируют,  добавляя к монослою, выращенному  в чашке Петри диаметром 50 мм, глутаровый. альдегид до концентрации 2,5%.

      2. После фиксации в течение 30 мин монослой дважды промывают  PBS и добавляют 10 капель 1% -ного раствора четы-рехокиси осмия.

      3. Через 15 мин монослой еще 2 раза  промывают PBS, снимают клетки со стекла и суспендируют их в 2 мл PBS.

      4. Клетки осаждают центрифугированием и дегидратируют, последовательно суспендируя в растворах с возрастающей концентрацией этанола; в каждом растворе клетки инкубируют 5 мин; при необходимости их можно выдержать в течение ночи в 70% -ном этаноле. После инкубации в 90% -ном этаноле клетки дважды по 15 мин обрабатывают 100% -ным этанолом.

      5. Этанол заменяют на смесь этанола  и окиси пропилена.

      6. Через 15 мин смесь этанол-окись  пропилена заменяют на свежую, инкубируют суспензию еще 30 мин,  после этого ресуспендируют клетки в смеси этанол-окись пропилена-среда EPON, а затем в среде EPON 1 ч.

      7. Компактный осадок клеток наносят  на небольшой объем среды EPON в капсуле ВЕЕМ и, заполнив капсулу средой EPON, инкубируют их 48 ч при 60 °С для полимеризации. После этого заключенные в капсулу клетки готовы для приготовления срезов стандартным способом на ультрамикротоме.

      8. Тонкие срезы располагают на  необработанных сеточках для  электронной микроскопии и через  24 ч окрашивают 5 мин,, помещая сеточки  препаратами вниз в каплю насыщенного раствора уранилацетата в метаноле.

      9. Сеточки промывают дистиллированной  водой и сушат на листе фильтровальной  бумаги.

      10. На срез наносят каплю 0,1 М  раствора NaOH и помещают сеточку срезом вниз на 5 мин в каплю раствора ацетата свинца. Сеточки промывают и сушат на листе фильтровальной бумаги, после этого они готовы к электронно-микроскопическому исследованию.

3.3.3 Сканирующая электронная микроскопия

      Для подготовки клеток к сканирующей  электронной микроскопии применяют  следующий метод.

      1. Клетки, образующие неплотный монослой на покровных стеклах, фиксируют 1-2 ч 2,5% -ным раствором глутарового альдегида в фосфатном буфере.

      2. Стекла помещают на 1 ч в 1% -ный раствор четырехокиси осмия в фосфатном буфере.

      3. Клетки дегидратируют, последовательно помещая стекла в 30, 50, 70, 90 и 100% -ный этанол, а затем на 15 мин в смесь этанола с ацетоном.

      4. Стекла дважды обрабатывают 100% -ным ацетоном и сушат С0₂ в критической точке, используя аппарат для сушки фирмы Polaran Equipment Ltd., Watford, Herts или другой аналогичный прибор.

      5. Покровные стекла фиксируют на  алюминиевых подложках с помощью  клея "Electrocday 915" и покрывают золотом с помощью диодного напылителя Polaron Е5000 или другой аналогичной системы. Подготовленные таким образом препараты можно исследовать методом сканирующей электронной микроскопии.

 

        

      На  рис.5 представлена фотография зараженных пневмо-вирусом клеток, выполненная с помощью сканирующей электронной микроскопии. Обратите внимание на длинные выросты инфицированных клеток.

3.3.4 Локализация и количественное определение вирусных антигенов по связыванию стафилококков

      Клетки  Staphylococcus aureus с помощью поверхностного А-белка связываются с Fc-фрагментами иммуноглобулинов. Этот эффект можно использовать для исследования пространственной локализации вирусного антигена на плазматической мембране зараженных клеток после их обработки противовирусной сывороткой. Стафилококки более удобны, чем покрытые А-белком шарики латекса, полиметил-метакрилата или полистирола, в связи с легкостью получения бактерий и одинаковым диаметром всех бактериальных клеток (около 1 мкм). На поверхности клеток, зараженных многими вирусами, стафилококки распределяются равномерно, но в случае пневмовирусов они специфически связываются с нитевидными выростами, образование которых является уникальной особенностью зараженных этими вирусами клеток. Связывание стафилококков высокоспецифично и подтверждает результаты иммунофлуоресцентного окрашивания, которые свидетельствуют о том, что вирусные антигены на поверхности зараженных клеток локализованы преимущественно в составе нитевидных структур.

      Связывание  стафилококков с поверхностью зараженных клеток проводят по следующей методике.

      1. Клетки выращивают на покровных  стеклах до образования монослоя  и заражают вирусом. Лучше всего использовать клетки почки кенгуровой крысы, поскольку они высокочувствительны к пневмовирусам и не имеют поверхностных выростов.

      2. Зараженные клетки инкубируют  в поддерживающей среде, промывают  PBS для полного удаления входящей в состав среды сыворотки, затем фиксируют 10-15 мин 2,5% -ным раствором глутарового альдегида в PBS при комнатной температуре.

      3. Клетки обрабатывают противовирусной  сывороткой 1 ч при 37 °С.

      4. Антисыворотку удаляют, тщательно  промывая клетки PBS. К клеткам добавляют суспензию aureus, штамм Cowan, приготовленную по методу Прингла и Парри, или коммерческий препарат стафилококков и инкубируют 5 мин при 37 °С.

      5. Несвязавшиеся стафилококки удаляют,  быстро промывая стекла PBS, и клетки фиксируют 60 мин при комнатной температуре 2% -ным раствором четырехокиси осмия в PBS. После этого стекла можно подготовить к сканирующей электронной микроскопии и исследовать.

      Подсчет числа связавшихся с клетками стафилококков дает возможность  количественно исследовать экспрессию вирусных антигенов на клеточной мембране при условии постановки соответствующих контролей.

3.4 Концентрирование вируса

 

      Предложен простой метод концентрирования РСВ преципитацией полиэтиленгликолем.

      1. Готовят 36% -ный раствор ПЭГ 6000 в дистиллированной воде.

      2. Раствор охлаждают и добавляют к содержащей вирус жидкости до конечной концентрации ПЭГ 6%.

      3. Суспензию инкубируют 2 ч при 4°С.

      4. Преципитат собирают центрифугированием  при 4°С.

      5. Супернатант сливают, осадок дважды  промывают буферным раствором  и ресуспендируют в небольшом объеме.

3.5 Очистка и радиоактивное мечение РСВ

 

      Клинические изоляты РСВ в основном ассоциированы  с клетками, однако при культивировании  некоторых лабораторных штаммов  в среду выделяется достаточное  количество вируса для успешной очистки. Наиболее удобно использовать для этого штаммы Лонг и А2.

3.5.1 Градиентное центрифугирование

      В литературе можно встретить не одну методику очистки РСВ градиентным  центрифугированием. Представленная ниже была успешно использована для очистки  штамма А2.

      1. Монослой клеток Нер-2 заражают РСВ. Адсорбцию проводят 2 ч при 37°С, затем добавляют культуральную среду.

      2. Через 10 ч после заражения добавляют  актиномицин D до концентрации 0,3 мкг/мл. Для радиоактивного мечения РНК через 16-20 ч после заражения заменяют культуральную среду на свежую, содержащую 20 мкКи/мл - уридина. Для введения метки в белки в среду добавляют 5 мкКи/мл - метионина.

      3. При проявлении ЦПД и образовании  синцитиев собирают культуральную  жидкость. Клеточный дебрис удаляют  центрифугированием 20 мин при 11000 g и концентрируют вирус центрифугированием 90 мин при 65000 g на холоду.

      4. Осадок ресуспендируют в буфере  NTE при ультразвуковой обработке.

      5. Вирус центрифугируют 1 ч при 150 000 g в 10-50% -ном градиенте концентрации сахарозы и собирают фракции, содержащие видимую зону вируса.

      6. Содержащие вирус фракции объединяют, разводят NTE и обрабатывают ультразвуком. Вирус вновь центрифугируют 2 ч при 150 000 g в 20-60% -ном градиенте концентрации сахарозы.

      7. Вирус концентрируют повторным  центрифугированием 90 мин при 65000 g.

      Данная  методика позволяет получить частично очищенные препараты радиоактивно меченного РСВ. Для последующей  очистки предложены более сложные методы; инфекционность, которая в обычных условиях очень чувствительна к центрифугированию, можно стабилизировать добавлением MgS0₄ до концентрации 1 М.

 

3.5.2 Очистка РСВ методом изопикнического центрифугирования

      Данный  метод требует более длительного  центрифугирования в градиенте  концентрации сахарозы или метризамида. Растворы метризамида обладают более низкой вязкостью и осмотическим давлением, чем растворы сахарозы, и поэтому их использование для изопикнического центрифугирования предпочтительно. Растворы метризамида всегда следует готовить непосредственно перед использованием на 10 мМ HEPES, рН 7,8.

3.6 Радиоактивное мечение вирионной РНК

 

      Интактную вирионную РНК РСВ получить трудно; рекомендуется следующая методика.

      Очищенный радиоактивно меченный вирус получают, РНК экстрагируют фенолом и далее  из водной фазы осаждают этанолом.

      Выделенную РНК очищают центрифугированием в 15 - 30% -ном градиенте концентрации сахарозы в присутствии ДДС-Na в течение 15 ч при 19 000 об/мин.

      Альтернативный  подход состоит в том, что РНК, экстрагированную из немеченых вирионов, метят по З'-концу с помощью  РНК-лигазы и - цитидин-3^/,5'-бисфосфата, как описано Вертц и Дэвисом. РНК можно пометить и по 5'-концу после удаления 5'-концевого фосфата щелочной фосфатазой из кишечника крупного рогатого скота, которую затем инактивируют протеиназой К. После этого РНК экстрагируют фенолом, осаждают этанолом и метят в присутствии - ATP и полинуклеотидкиназы из Е. coli, зараженной бактериофагом Т4. Меченую РНК затем отделяют от непрореагировавшего АТР хроматографией на колонке с сефадексом G50. Методика, удобная для мечения РНК РСВ, описана Шубертом и др. .