Группа пневмовирусов

 

3.7 Анализ вирусных РНК и белков методом электрофореза в полиакриламидном геле

3.7.1 Анализ белков

      Синтезированные in vivo или in vitro меченые белки можно анализировать с помощью электрофореза в 10% -ном или б - 15% -ном градиентном полиакриламидном геле, как описано Марсденом и др. .

      После электрофоретического разделения в  полиакриламидном геле белки можно  перенести на нитроцеллюлозный фильтр для биохимического или иммунологического  анализа. Применение этого метода к  белкам РСВ описано Хиерхольцером и др. Перенос белков из. полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу осуществляется электрофоретически по нижеследующей методике.

      1. После электрофоретического разделения  белков полиак-риламидный гель  помещают в камеру прибора  для электрофоретического переноса вместе с листом нитроцеллюлозы. В камеру заливают буферный раствор, содержащий 0,025 М трис, 0, 193 М глицин и 20% метанола, рН 8,35.

      2. Для переноса проводят электрофорез  при 60 В по крайней мере 4 ч  при 4°С.

      3. Лист нитроцеллюлозы разрезают на полоски и помещают каждую в закрытую пробирку.

      4. Полоски инкубируют с анти-РСВ  сывороткой 2 ч при комнатной температуре.

      5. Полоски 3 раза промывают PBS, содержащим твин 80.

      6. Полоски инкубируют с конъюгатом, разведенным в 1000 раз, 3 ч при комнатной температуре.

      7. Полоски 3 раза промывают тем  же раствором.

      8. Нитроцеллюлозу проявляют раствором,  содержащим 50 мг 3,3'-диаминобензидина  и 100 мкл 3% -ной перекиси водорода в 100 мл PBS, рН 7,2.

      9. Нитроцеллюлозу промывают водой  и сушат на листе фильтровальной  бумаги.

      10. Количественный анализ можно провести спектрофотометрически после обработки нитроцеллюлозы веществами, растворяющими пластмассы. В результате подобной обработки нитроцеллюлоза становится прозрачной.

3.7.2 Анализ РНК

      Радиоактивно  меченную РНК из очищенных вирионов или из цитоплазмы зараженных РСВ клеток можно проанализировать электрофорезом в 1,5% -ном геле агарозы, содержащем 6 М мочевину, по следующей методике.

      1. Для приготовления геля размером 50X17X0,3 см готовят отдельно следующие  растворы: а) 120 мл 4,5% -ной агарозы; для растворения агарозы суспензию обрабатывают в микроволновой печи или автоклавируют ее; б) 1,5-кратный концентрат раствора мочевины в цитратном буфере; для этого к 129,6 г мочевины добавляют 9 мл концентрированного 1 М цитратного буфера и растворяют, доводя объем водой до 240 мл.

      2.1,5-кратный буфер нагревают и смешивают с 3-кратным концентратом агарозы.

      3. Гель заливают на холоду в  горизонтальный аппарат для электрофореза  в 3 стадии, перерывы между стадиями  составляют 45 мин.

      4. В гель немедленно вводят гребенку.

      5. Гель используют для электрофореза  через 2-3 ч после заливки. Гребенку  вынимают, промывают ячейки буфером  с мочевиной и заполняют их  тем же буфером. В ячейки  вносят образцы, смешанные с  буфером для нанесения.

      6. Электрофорез проводят на холоду при градиенте напряжения 5 В/см в течение 18 ч. Основные растворы готовят следующим образом.

      1 М цитратный буфер, рН 3,0: смешивают  1 М растворы лимонной кислоты  и цитрата натрия до достижения  рН 3,0. Буфер для электрофореза: 1 М. цитратный буфер разводят в 40 раз, получая 0,025 М цитратный буфер, рН 3,0 Буфер для нанесения образцов: 0,025 мл 1 М цитратного буфера, 3,6 г 6 М мочевины, 2 г 20% -ной сахарозы, 0,1 мл 0,005% -ного бромфенолового синего, объем доводят водой до 10 мл. Буфер с 6 М мочевиной: 3,6 г мочевины, 0,25 мл 1 М цитрата, рН 3,0; объем доводят до 10 мл дистиллированной водой.

3.8 Очистка матричной РНК для трансляции

 

      Матричную РНК для трансляции in vitro получают следующим образом.

      1. 50-Ю⁶ клеток заражают РСВ. Клетки инкубируют 10-12 ч при 37 °С.

      2. Монослой промывают, снимают клетки  со стекла и суспендируют в  буферном растворе. Суспензию оставляют  на 10 мин при 4°С для набухания  клеток.

      3. Клетки разрушают в гомогенизаторе  Даунса, затем осаждают клеточный  и дебрис центрифугированием при 4°С.;

      4. Осадок ресуспендируют в 2 мл  того же буфера, вновь гомогенизируют  и центрифугируют. Супернатанты, полученные  после первого и второго центрифугирований,  объединяют.

      5. К супернатанту добавляют CsCl и N-лаурилсаркозин. Раствор тщательно перемешивают и прогревают 1-2 мин при 51 °С.

      6. 7 мл полученного раствора наслаивают на 2 мл раствора в пробирке для ротора SW40 и добавляют сверху буфер, чтобы заполнить пробирку. Пробирки центрифугируют в роторе SW40 16 ч при 25000 об/мин и 25 °С.

      7. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл  стерильной дистиллированной воды. РНК дважды переосаждают этанолом, добавляя 1,2 мл этанола, 25 мкл 4 М  раствора NaCl и 10 мкл 10% -ного ДДС-Na.

      8. После второго осаждения осадок  ресуспендируют в буфере, добавляют  ДДС-Na до концентрации 0,2% и проводят хроматографию на колонке с олиго - целлюлозой. Связавшийся материал элюируют и осаждают РНК этанолом, добавляя в ка* честве носителя тРНК из печени кролика. Осадок ресуспендируют в том же буфере без ДДС-Na и переосаждают РНК двумя объемами этанола в присутствии 0,2 М ацетата калия. Конечный осадок ресуспендируют в 250-500 мкл 0,01 М HEPES, рН 7,6. В качестве бесклеточной системы для синтеза белка можно использовать зависимый от мРНК лизат ретикулоцитов кролика, приготовленный, как описано Престоном, или коммерческий препарат лизата. Для контроля следует параллельно получить мРНК из незараженных клеток. Индивидуальные вирусные мРНК для трансляции в бесклеточной системе можно выделить методом гибридизационной селекции с использованием клонов кДНК с известной структурой, как описано Коллинзом и Вертц.

3.9 Молекулярное клонирование и олигонуклеотидное секвенирование

 

      10 генов РСВ были идентифицированы  в результате клонирования кДНК  с последующим картированием  и трансляцией вирусных мРНК - кДНК получали обратной транскрипцией мРНК из зараженных РСВ клеток Нер-2 и клонировали их в Е. coli с использованием плазмиды pBR322.

      Нуклеотидная  последовательность гена белка нуклеопротеи-на РСВ и кодируемая ею аминокислотная последовательность - опубликованы Венкатесаном и Эланго, а последовательности гена и белка М. - Сатаке и Венкатесаном. В этих работах подробно описаны методы олигонуклеотидного секвенирования в применении к РСВ.

 

3.10 Очистка вирусных белков

3.10.1 Вирусные полипептиды

      В настоящее время очищенные вирусные белки можно получать методом аффинной хроматографии с использованием специфических моноклональных антител. Другой подход состоит в экспрессии клонированных генов в прокариотических или в эукариотических клетках. Однако непосредственно для РСВ такие методики пока не описаны.

3.10.2 Очистка капсидного белка

      Капсидный белок выделяют из очищенных нуклеокапсидов, которые в свою очередь можно  получить либо из вирионов, либо из экстракта  зараженных клеток. Ниже приведена  методика выделения из клеточных экстрактов, дающая более высокий выход.

      50-Ю⁶ клеток заражают РСВ. Через 36-48 ч после заражения клетки снимают с поверхности флакона раствором, содержащим 10 мМ трис-НО, рН 7,4, 0,18 М NaCl, 0,25 мМ ЭДТА и 0,1 мМ PMSF. Клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 1мл лизирующего буфера 20 мин при 4°С. Клетки разрушают в гомогенизаторе Даунса. К гомогенату добавляют NaCl до концентрации 0,1 М и удаляют неразрушенные клетки, ядра и дебрис центрифугированием 2 мин при 600 g. Нуклеокапсиды осаждают центрифугированием 30 мин при 100000 g. Нуклеокапсиды промывают лизирующим буфером, а затем буфером, содержащим 10 мМ трис-HCl, рН 7,4, и 0,1 мМ ЭДТА. Осадок нуклеокапсидов ресуспендируют и получают очищенные нуклеокапсиды изопикническим центрифугированием в 15-55% -ном градиенте концентрации тартрата калия в буфере ТЕ.

 

3.10.3 Очистка вирионных гликопротеинов

      Предложен метод очистки гликопротеинов РСВ, основанный на солюбилизации вирионов неионным детергентом в буферном растворе с низкой ионной силой.

      1. Очищенные методом градиентного центрифугирования вирионы осаждают центрифугированием через слой 30% -ного раствора сахарозы в буфере NTE при 50 000 g 60 мин. Осадок ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 10% тритона Х-100.

      2. Суспензию перемешивают 30 мин при  комнатной температуре и центрифугируют 60 мин при 200 000 g.

      3. Супернатант экстрагируют п-бутанолом.

      4. Экстрагированные белки суспендируют  в 0,01 М фосфатном буфере с  1% тритона Х-100 и фракционируют  в 5-25% -ном линейном градиенте концентрации сахарозы, содержащем 1% тритона Х-100, 18 ч при 100 000 g. Собирают фракции из верхней части градиента и диализуют их против 0,01 М фосфатнога буфера.

      5. Тритон Х-100 удаляют экстракцией  п-бутанолом.

      6. Фракции, содержащие вирусные гликопротеины, идентифицируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

 

4. Специальные  биологические методы

4.1 Получение моноклональных антител

 

      Моноклональные  антитела к нескольким белкам РСВ были получены стандартными методами. Ниже приведен типичный протокол.

      1. Мышам линии Balb/c внутрибрюшинно вводят зараженные РСВ клетки. Через 10 сут. инокуляцию повторяют.

      2. Селезенки иммунизированных мышей  суспендируют в среде RPM1 1640, забуференной бикарбонатом натрия и содержащей пенициллин, гентамицин, пируват натрия, L-глютамин и ЭТС.

      3. Клетки селезенки иммунизированных  мышей сливают с клетками мышиной  миеломы, например Balb/c NS1/1, выращиваемой в той же среде. При этом смешивают 3-10⁷ клеток селезенки с таким же количеством клеток миеломы. Клетки центрифугируют 10 мин при 200 g и 1 мин выдерживают при 37 °С. Для слияния клеток по каплям добавляют 1 мл 50% -ного ПЭГ 4000 с 5% ДМСО.

      4. Суспензию инкубируют 90 с при  37 °С и останавливают процесс  слияния, добавляя 20 мл среды.

      5. Клетки осаждают центрифугированием и промывают средой. Осадок ресуспендируют в среде ГАТ и распределяют по плоскодонным лункам планшета для иммунологических реакций.

      6. Клетки инкубируют на питательном  слое из макрофагов, подготовленном  за сутки до слияния; каждая  лунка должна содержать 10" перитонеальных макрофагов здоровой мыши.

      7. Через 6 сут после начала инкубации  в каждую лунку вносят по 50 мкл среды ГАТ.

      8. Через 9-12 сут после слияния  проверяют активность и специфичность  продуцируемых антител методом  ELISA с антигенами РСВ.

      9. Гибридомы, продуцирующие специфические  антитела, клонируют методом предельного  разведения в планшете для  иммунологических реакций, используя  макрофаги или клетки селезенки  в качестве фидера. Клонирование  проводят дважды. Гибридомы считают  стабильными, если 95% клонов продуцируют специфические антитела.

4.2 Выделение температурно-чувствительных мутантов

 

      Для анализа функций генов и биохимических  исследований полезно иметь температурно-чувствительные мутанты вируса. Их выделяют следующим  образом.

      1.10⁶ клеток BS-C-1, выращенных в чашке Петри диаметром 50 мм или во флаконе с завинчивающейся крышкой емкостью 30 мл, заражают РСВ дикого типа с множественностью инфекции 0,01 БОЕ/кл. Адсорбцию проводят 1 ч при 31 °С.

      2. Вирус отмывают двумя сменами  среды и добавляют 3 мл среды Игла, содержащей 2,5% ЭТС и мутаген.

      3. Культуру инкубируют при 31 °С  до проявления ЦПД в контрольной  зараженной культуре, к которой  мутаген не добавляли.

      4. Разведения культуральной жидкости  из обработанных мутагеном культур  титруют методом бляшек после осветления, но без замораживания и оттаивания. Для этого на клетки наносят необходимые разведения и инкубируют клетки, под 0,9% -ным агаровым покрытием 5-7 сут при 31 °С.

      5. Вирус из полученных индивидуальных  бляшек наращивают, перенося бляшки пастеровской пипеткой на свежие монослойные культуры.

      6. Проводят скрининг полученных  изолятов вируса на способность  давать бляшки при 31 и 39 °С. Для этого зараженные чашки  инкубируют параллельно при каждой  температуре. Альтернативный метод  состоит в прямом скрининге бляшек, образованных вирусом, обработанным мутагеном. Для этого 2 чашки с культурой, покрытой слоем 0,9% -ного агара толщиной 2 мм, делят на секторы и в каждый сектор помещают 1 бляшку., После адсорбции в течение 30 мин при 31 °С заливают второй слой агарового покрытия. После этого одну чашку инкубируют при 31 °С, а другую при 39 °С. Из секторов, где бляшки образуются при 31 °С, но не при 39 °С, их извлекают для дополнительной проверки.