Микробиологическая лаборатория. Микроскоп и техника микроскопирования

     Обжечь края пробирки.

     Ввести остывшую петлю в пробирку  и взять небольшое количество  микробной массы, слегка прикасаясь  к культуре и не царапая  плотную питательную среду   петлей. Если микроорганизмы выращены  в жидкой питательной среде,  то берется петлей капля жидкости.

     Снова обжечь в пламени горелки  края пробирки, часть ватной пробки  и закрыть пробирку пробкой.

     Взятый материал эмульгировать в имеющейся на предметном стекле капле воды и равномерно тонким слоем распределить по поверхности (готовят мазок).

     Снова обжечь петлю в пламени,  чтобы уничтожить оставшиеся  в ней микроорганизмы.

2. Как приготовить препараты для прижизненной микроскопии микробов? Каковы преимущества и недостатки этого метода?

   Существует  два основных способа приготовления  прижизненных препаратов микроорганизмов: «висячая капля» и «раздавленная  капля».

   1 Препарат «висячая капля». Небольшую  каплю взвеси микробных клеток наносят на покровное стекло и осторожно накладывают на него предметное стекло так, чтобы капля свободно помещалась в центре углубления. Края луночек предварительно смазывают вазелином, препарат переворачивают и микроскопируют. Этот метод применяют, главным образом, для изучения подвижности микроорганизмов.

   2 Препарат «раздавленная капля»  неокрашенный (нативный). На предметное стекло наносят каплю жидкости (при работе с бактериями - водопроводную воду, при работе с микроскопическими грибами - смесь равных объемов этилового спирта и глицерина), вносят в нее немного исследуемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом, осторожно накладывая его по ребру во избежание образования пузырьков. Излишек выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Выращенные на плотной питательной среде бактерии переносят в каплю жидкости с помощью бактериологической иглы, а микроскопические грибы - двумя препаровальными иглами. Культура, выращенная в жидкой среде, например, дрожжи, помещается на предметное стекло стерильной пипеткой без предварительного нанесения капли жидкости. Микроскопируют препарат сухими объективами. Препарат позволяет установить форму клеток преимущественно крупных микроорганизмов, их размеры, расположение, подвижность.

   3 Препарат «раздавленная капля»  прижизненно окрашенных микроорганизмов.  К капле микробной суспензии  на предметном стекле добавляют  каплю слабого раствора (1:1000) красителя  (метиленового синего или фуксина), размешивают, затем накрывают  покровным стеклом .

   Подобным  образом рекомендуется дифференцировать живые и мертвые клетки, например, при исследовании пекарских дрожжей. Мертвые клетки обычно прокрашиваются быстрее и ярче за счет посмертного повышения проницаемости клеточной оболочки.

   Отработанные  препараты живых микроорганизмов  помещают в сосуд с дезинфицирующим  раствором  для обезвреживания.

3. Техника приготовления фиксированного препарата.

   В приготовлении фиксированного препарата  различают несколько этапов:

   1) Приготовление мазка. На обезжиренное  чистое предметное стекло наносят  каплю воды, вносят в нее небольшое  количество исследуемой культуры  бактерий, взятой с плотной питательной  среды стерильной бактериологической  петлей, растирают ее тонким слоем  на поверхности с двух-, трехкопеечную  монету. Мазок должен быть тонким, равномерно растертым, небольшим.

   В случае роста бактерий на жидкой питательной  среде на стекло наносят только каплю  микробной взвеси.

   2) Высушивание мазка на воздухе  при комнатной температуре для  удаления лишней влаги.

   3) Фиксация мазка. Стекло с мазком, обращенным кверху, проводят 3-4 раза  в пламени спиртовки. Это термическая  фиксация. При химической фиксации  мазок обрабатывают  этиловым, метиловым  спиртом, смесью спирта с эфиром, но такая фиксация более длительна.

   При фиксации микробы погибают, клетки прикрепляются к стеклу, улучшается их окрашиваемость.

   4) Окрашивание препарата. Обработка  различными красителями  для  контрастирования микроорганизмов.

4. Какие существуют способы фиксации и окраски бактериальных препаратов?

   Существуют  термический и химический способы  фиксации.

   Стекло  с мазком, обращенным кверху, проводят 3-4 раза в пламени спиртовки. Это  термическая фиксация. При химической фиксации мазок обрабатывают  этиловым, метиловым спиртом, смесью спирта с  эфиром, но такая фиксация более  длительна.

   При фиксации микробы погибают, клетки прикрепляются к стеклу, улучшается их окрашиваемость.

   В лабораторной практике существуют простые  и сложные способы окрашивания.

   Простая окраска позволяет быстро и хорошо ознакомиться с общей морфологией  микроорганизмов. При этом употребляется  только один краситель, чаще всего фуксин (красный цвет) или метиленовая  синька (синий цвет). Фуксин красит быстрее (1-2 мин), интенсивнее и окрашивает все виды бактерий. Метиленовая синька красит медленнее (3-5 мин), менее ярко, но препараты получаются более четкими. Простую окраску препаратов применяют, главным образом, для обзорной микроскопии.

   Сложные способы окраски заключаются  в последовательном применении нескольких красителей. Они служат для дифференциации видов микроорганизмов по способности  к окрашиванию (тинкториальные свойства) или для выявления отдельных клеточных структур.

   Универсальным методом из сложных способов окраски  является окраска по методу Грама. 

5. Для чего предназначена  окраска по методу Грама? Опишите методику окраски.

   Универсальным методом из сложных способов окраски  является окраска по методу Грама. Она является дифференциальной и широко используется для определения видовой принадлежности бактерий. По способности окрашиваться по методу Грама все бактерии делятся на грамположительные (гр+)   и грамотрицательные (гр-).

   Грамположительные бактерии удерживают комплекс красителя  генцианвиолетового с йодом при обработке спиртом и поэтому окрашиваются в сине-фиолетовый цвет; грамотрицательные бактерии не обладают такой способностью и обесцвечиваются спиртом. При последующей обработке фуксином они приобретают красную окраску.

   Способность бактерий окрашиваться по Граму в настоящее время связывают с молекулярной организацией и химическим составом клеточной стенки бактерий.

   Техника окраски по методу Грама состоит в следующем:

1. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, наливают 2-3 капли генцианвиолета и окрашивают в течение 2-х минут;
2. Бумагу снимают и, не промывая водой препарат, наносят на мазок 2-3 капли раствора Люголя, выдерживая реактив 2-3 мин;
3. Сливают реактив Люголя и для обесцвечивания наносят на мазок 96%-ный этиловый спирт на 30 с;
4. Промывают препарат водой;
5. Для дополнительной окраски наливают на мазок водный раствор фуксина на 1-2 мин;
6. Промывают препарат водой, промокают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионным объективом.

   Вывод: Морфология микроорганизмов изучает их внешний вид, форму, строение клеток, подвижность, спорообразование и способы размножения.

   Бактерии - это большая группа мельчайших одноклеточных организмов, размножающихся путем деления клетки пополам.

   По  своей форме бактерии подразделяются на шаровидные (кокки), палочковидные (палочки) и извитые (спириллы, спирохеты, вибрионы). Шаровидные бактерии встречаются в виде микрококков, диплококков, тетракокков, стрептококков, стафилокков, сарцин.

   Познакомились с методами изучения морфологии бактерий под микроскопом в прижизненных и фиксированных окрашенных препаратах; ознакомились с правилами обращения с культурами микроорганизмов.