Модификация иммуноглобулина G быка, специфичного к вирусу инфекционного ринотрахеита, и исследование физико-химических параметров получе

      Предложено  использовать для регуляции функциональных свойств гемоглобина высокомолекулярные полианионы на основе декстрана, препараты  которого (реополиглюкин, диальдегиддекстран) нашли широкое применение в медицине плазмозаменителей и антитромбических средств [2]. Показано, что полисахаридные производные, содержащие дифосфатные  и карбоксильные группы, являются эффективными регуляторами обратимой  оксигенации молекул гемоглобина. Отмечено также, что введение реополиглюкина и декстрана затрудняет разворачивание белковой глобулы при нагревании. Связывание с диальдегиддекстраном увеличивает термостабильность  с 60°С до 80°С. Сделан вывод о том, что диальдегиддекстран может быть использован в экспериментах  по синтезу биологически активных веществ  и лекарственных средств для  сохранения их биологически важных свойств  и способности выполнять физиологическую  роль в организме при изменении  условий среды [17].

      Поливинилпирролидон образует комплексы как с низко-, так и с высокомолекулярными  соединениями за счет водородных связей, гидрофобных и других нековалентных  взаймодействий [31]. Он используется как  плазмозаменитель и его способность  к комплексообразованию применяется  для пролонгирования действия лекарственных  препаратов. При введении в организм физиологически активных веществ в  концентрированных растворах поливинилпирролидона достаточной молекулярной массы  наблюдается повышение растворимости  действующего начала, а также 2-3-кратное (а иногда и большее) увеличение времени  его действия при одновременном  снижении токсичности. Возможности  применения комплексов полимеров с физиологически активными веществами для создания лекарственных форм пролонгированного действия достаточно широки вследствие простоты их получения и значительной универсальности. В медицине уже применяется ряд препаратов такого типа, в частности отечественный «Морфолонг», содержащий морфин [31]. 

       Глава II. Материалы и методы 

     В качестве сырья для выделения  иммуноглобулинов G использовали плазму, переболевших инфекционным ринотрахеитом  животных, с добавлением Na₃(PO₄) в качестве антикоагулянта.

     Выделение проводили по схеме, представленной на рис.

     При проведении нехроматографических стадий использовали сульфат аммония («Реахим»).

     Для приготовления буферов и проведения аналитических процедур использовали:

• трисоксиметиламинометан, сульфат аммония, глицин, β-меркаптоэтанол, акриламид («Диа-^эМ», Россия);
• метиленбисакриламид, цитохром С, тэтраметилэтилендиамин, метиленбисакриламид, персульфат аммония, додецилсульфат натрия, тетраметилэтилендиамин, бромфеноловый синий – натриевая соль, кумасси бриллиантовый синий R-250 («Serva», Германия);
• хлорид натрия, гидроксид натрия, дигидрофосфат натрия, азид натрия, соляная кислота, уксусная кислота, трихлоруксусная кислота, лимонная кислота, сахароза, глицерин («Реахим», Россия);
• тимеросал («Loba chemie», Австрия);
• агароза D-1 HIGH EEO («Pronadisa», Испания).
• амидочёрный 10Б («Reanal», Венгрия).

     Все использованные российские реактивы марки  ХЧ, ЧДА, или ОСЧ.

     Измерения рН производились на калиброванном  лабораторном универсальном ионометре  «ЭВ-74» (Россия), рН-метре «Radelkis» (Венгрия).

     Анионообменную  хроматографию проводили в режиме сорбции примесных белков на шприцевой  колонке объемом 50 мл в два этапа. Использовали сорбент ДЭАЭ-целлюлозу DE-32 (Whatman, Англия). Для выделения IgG использовались следующие элюирующие растворы:

  - 0,01 М Трис-HCl буфер с рН 8,0 (электропроводность 1,2х10³ мкСм/см³ по кондуктометру «ЕР-METER» (США)).

     Для десорбции использовался 2М NaCl. Скорость элюции составляла 15 см/час.

     Для выделения мономерных форм и определения  молекулярных параметров активированного  совиаля и модифицированных форм IgG использовали эксклюзионную хроматографию  на колонке с параметрами: 467 мм² х 820 мм (Кириши, Россия). Использовали сорбенты Sephadex G-150 (предел фракционирования 300 кДа) и Sephacryl S-200 (предел фракционирования 250 кДа) (Pharmacia, Швеция). В качестве элюента применяли 0,9%-ный р-р NaCl. Скорость элюции поддерживали в пределах от 4 (для сефадекса) до 8 (для сефакрила) см/час.

     Концентрацию  белка определяли спектрофотометрически  по оптической плотности при длине  волны 280 нм (для всех фракций использовался  коэффициент экстинкции 1,4) на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия) [88].

     Выход белка определяли как отношение  количества белка на данной стадии к количеству выделяемого белка  в сырье и выражали в процентах. Процент распределения рассчитывали как отношение количества белка  в данной фракции к суммарному количеству белка во всех фракциях данной стадии разделения.

     Для химической модификации специфического IgG быка использовали совиаль (сополимер поли-N-винилпирролидона с диацетальакролеином) со средневзвешенной молекулярной массой 30 кДа и содержанием акролеиновых звеньев 14 моль% (т.е. при активации совиаля максимальное количество образовавшихся альдегидных групп соответствует примерно 14 на 1 молекулу совиаля). Производитель – Институт высокомолекулярных соединений (г.Санкт-Петербург, Россия).

     Мольные соотношения белок/полимер рассчитывали, исходя из содержания превалирующе модифицируемой аминокислоты лизина в тяжелой цепи IgG быка, равного 6 моль% (количество аминокислотных остатков лизина делили на общее количество аминокислот в тяжелой цепи). Количество остатков лизина в тяжелой цепи IgG быка подсчитывали с помощью компьютерной программы Blast, интегрированной в электронный ресурс www.pubmed.com. Данные об аминокислотной последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина G быка брали там же. IgG и совиаль объединяли в соотношениях 1/1, 1/3, 1/5.

     Постадийные образцы, конечные образцы и модифицированные формы IgG анализировали в Диск-электрофорезе  в градиентном (3-25%) ПААГ в диссоциирующих (в присутствии SDS) и диссоциирующих-восстанавливающих  условиях (в присутствии SDS и β-меркаптоэтанола) по методу Лэммли c модификациями [90]. Гели после ЭФ-ПААГ сканировали и  анализровали количественно с помощью компьютерной программы Image J.

     Зарядовые характеристики модифицированных форм оценивали в агрозном электрофорезе (трис-барбиталовый электродный буфер, рН=8,6, напряжение 150-200 В) [90].

     Модифицированные  и нативную формы IgG подвергали термоинактивации в течение 10 часов при 60 °C, в том  числе в присутствии антибиотика  гентамицина в концентрациях 5, 10, 15 мг/мл.

     Мутность  нативной и модифицированных форм IgG до и после термоинактивации измеряли при 540 нм на СФ-46. Вязкость измеряли с  помощью лабораторного визкозиметра, предназначенного для определения  вязкости крови, в сравнении с  водой. 
 
 

       Глава III. Результаты и их обсуждение. 

3.1.Выделение IgG КРС 

      Для проведения исследования была использована сыворотка крови крупного рогатого скота, больного/переболевшего инфекционным ринотрахеитом. Для модификации использовался IgG быка, который выделяли по схеме, представленной на рис. Схема составлена согласно предыдущим исследованиям по способам выделения IgG КРС, которые проводились в лаборатории на кафедре биохимии и биотехнологии. Ключевыми этапами выделения являются: осаждение сульфатом аммония, анионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе и эксклюзионная хроматография на Sephadex G-150.

      Осаждение IgG КРС сульфатом аммония.

      Для получения γ-глобулиновой фракции было проведено осаждение сульфатом аммония 40% от насыщения при pH=8,0 в течение 30 минут при интенсивном перемешивании. Далее центрифугирование 5000 об/мин в течение получаса. После центрифугирования осадок ресуспендировали в физ. растворе для удаления примесных белков. Эту процедуру повторили еще 2 раза. Далее сульфатный осадок диализовали против 6 литров дистиллированной воды в течение суток.

      Анионообменная  хроматография.

      На колонку с анионообменником наносили обогащенную иммуноглобулиновую фракцию, полученную на стадии осаждения.

      Перед проведением анионообменной хроматографии  диализованную против воды фракцию диализовали против Tris-HCl буфера ( рН 8,0, μ=1,2·10³ мкСм/см³ ). После чего образец наносили на колонку. В результате получили два пика: транзитный и десорбирумый. Последний концентрировали (осаждение СА, 33% от насыщения), диализовали против воды ( 3ч ) и против 0,9% NaCl. 

      Эксклюзионная хроматография.

      При проведении схемы выделения сывороточного IgG в нее была включена эксклюзионная хроматография на Sephadex G-150, позволяющая удалить из целевого продукта различные остаточные примеси, остатки альбумина, фрагменты и олигомеры IgG, а так же белки сходные по изоэлектрической точке с IgG, но отличающиеся по молекулярной массе от такового.

      Хроматографию проводили на сорбенте Sephadex G-150 (Pharmacia, Швеция), который позволяет повысить чистоту целевого белка.

      Целевой пик проверяли на электрофоретическую однородность и наличие фрагментированных форм и олигомеров.

     Следующим этапом данной работы было проведение модификации полученного BIgG.  
 
 

Рис. 1. Схема выделения  BIgG – ИРТ – 2010

 

 

 

 
 
 

 
 

 
 
 
 
 

Таблица 2

Количественные  данные по выделению  BIgG – ИРТ - 2010