Модификация иммуноглобулина G быка, специфичного к вирусу инфекционного ринотрахеита, и исследование физико-химических параметров получе

 

2. Модификация BIgG, специфичного к ИРТ, сополимером поливинилпирролидона с диацетальакролеином (совиалем).

     Установлено, что альдегидные группы совиаля реагируют в основном с e-аминогруппами лизиновых остатков белка [93]. При нейтральных значениях рН среды на поверхности молекулы белка находится большая часть остатков лизина. При увеличении рН раствора за счет возрастания общего отрицательного заряда молекулы происходит «расталкивание» белковых глобул и их расширение. В этом случае число доступных e-аминогрупп лизина увеличивается. При этих же условиях происходит их депротонирование и образование неподеленной электронной пары на атоме азота. При взаимодействии с активированными альдегидными группами сополимера, которые имеют частично положительный заряд на атоме углерода, происходит образование азометиновой связи.

     Согласно  написанному выше модификацию сывороточного иммуноглобулина G КРС проводили в условиях образования азометиновой связи при рН 9,5±0,1. Именно в этих условиях депротонируются ε-аминогруппы остатков лизина на молекуле белка, которые могут реагировать с альдегидными группами совиаля [31].

     В рамках тематики синтеза конъюгатов полимер-белок существует проблема сайт-специфического связывания полимера с белком для создания химерной молекулы определенной структуры и с заранее  прогнозируемыми (заданными) свойствами. Подходы к решению этой проблемы связаны с введением в белок  ограниченного числа полимеризующихся или инициирующих полимеризацию  групп таким образом, чтобы их локализацию можно было определить заранее [5].

     В случае модификации специфического IgG быка в соответствии с целью необходимо было подобрать такие условия, чтобы получить химерную молекулу IgG, сохраняющую свои нативные свойства после теста на термостабильность в присутствии денатурирующего агента (гентамицина) и без него. При этом конечная концентрация белка после модификации должна была быть не менее 50 мг/мл, что соответствует минимальной допустимой концентрации белка в иммуноглобулиновых препаратах.

     Условия активации совиаля (концентрация сополимера и соляной кислоты) соответствовали  таким, при которых активируется максимальное количество акролеиновых звеньев и при этом не происходит гидролиза сополимера.

     Наиболее  важным являлся выбор мольных  соотношений белок/сополимер, так  как от этого параметра зависит  степень модификации молекулы IgG, а значит степень изменения его конформации и нативных свойств, а также молекулярные параметры конъюгата.

     На  основании данных, полученных ранее  в лабораториях кафедры биохимии и биотехнологии, были выбраны следующие  параметры модификации:

  – концентрация совиаля при активации 150мг/мл, концентрация HCl 0,1М.

  – соотношения белок/полимер: 1/1, 1/3, 1/5. При большем избытке сополимера наблюдается потеря антительной активности свыше 70%.

     Активация совиаля. Взвесив необходимое количество сополимера (в пенициллиновом флаконе) на аналитических весах, навеску растворить в 0,05 н. HCI. Раствор перенести в коническую градуированную пробирку и закрыть пробкой. Пробирку с реагентом инкубировать на водяной бане при температуре 100⁰С в течении 2 часов. В охлажденном растворе активированного совиаля довести рН до 7,0 с помощью 0,1 М гидроксида натрия; рН контролируется индикаторной бумагой.

     Модификацию проводили под контролем рН, поддерживая его в пределах 9,5 – 9,6 с помощью 1M NaOH (объем добавленной щелочи фиксировали) в течение 2 часов. Падение рН документировали. После окончания модификации рН в образцах доводили до нейтральных значений с помощью 1M HCl. Концентрацию белка в модифицированной форме рассчитывали по исходному количеству белка, которое было взято для модификации с учетом конечного объема раствора модифицированной формы.

Количественные  соотношения реагентов  при модификации. Таблица 3

3. Количественная оценка степени модификации.

     Одним из показателей качества полученных конъюгатов является полнота модификации, выражающаяся в доле промодифицированных молекул IgG. Этот показатель важен с точки зрения однородности модифицированной формы, чтобы избежать дополнительных стадий очистки при производстве специфических иммуноглобулиновых препаратов пролонгированного действия, устойчивых к денатурирующим воздействиям. Очевидно, что термообработка, как неотъемлемый этап обеспечения инфекционной безопасности таких биопрепаратов, будет денатурировать непромодифицированные молекулы IgG и снижать общую эффективность и качество препарата.

     Полноту модификации оценивали в сравнительном анализе двумя методами, основанными на разделении макромолекул по молекулярной массе: электрофорезом в полиакриламидном геле в диссоциирующих-восстанавливающих условиях и с помощью эксклюзионной хроматографии. ЭФ-ПААГ обладает большей точностью, однако крупные конъюгаты могут не входить в поры полиакриламидного геля, что выражается в занижении результата оценки. В свою очередь эксклюзионная хроматография, проводимая традиционно в нативных условиях, может давать завышенные результаты количественной оценки полноты модификации вследствие нековалентной полимеризации непромодифицированных молекул IgG.

     Таким образом, сопоставление результатов, полученных двумя методами, дает адекватную оценку полноты модификации.

     Результаты  оценки степени модификации, полученные с помощью эксклюзионной хроматографии  и ЭФ-ПААГ (в диссоциирующих-восстанавливающих  условиях) в сравнении представлены в таблице 4. 
 
 

     Таблица 4

     Оценка  степени модификации  с помощью эксклюзионной  хроматографии на Sephacryl S-200 и с помощью ЭФ-ПААГ в диссоциирующих-восстанавливающих условиях. 

 

     Примечание: В скобках даны проценты выхода по двум основным фракциям эксклюзионной  хроматографии: конъюгаты и непромодифицированные  молекулы, отнесенные ко всему спектру  молекулярных масс образца.

     В результатах электрофореза доля мономерного IgG отражена в трех числах (сверху вниз в ячейке) – доля тяжелой цепи, доля легкой цепи и сумма, отражающая долю непромодифицированных молекул.

     Соответствующие графики ЭХр и электрофореграммы представлены на рис. 2 и рис. 3.

 

  Рис. 2. Эксклюзионная хроматография модифицированных форм BIgG коровы на Sephacryl S-200 (предел фракционирования 250 кДа). По оси ординат ОП (280 нм.). По оси абсцисс № фракции (Объем 3 мл). Пики идентифицировали с помощью ЭФ-ПААГ в диссоциирующих и дисоциирующих восстанвливающих условиях.

 

  Рис. 3. Электрофорез в градиентном (3-25%) ПААГ модифицированных форм иммуноглобулина G коровы. Условия диссоциирующие (трек 1-4) и диссоциирующие-восстанавливающие ( трек 5 – 8 ).

     В электрофорезе видно, что с увеличением  мольного избытка совиаля доля и  средневзвешенная молекулярная масса  конъюгатов белка с совиалем возрастает, т.е. молекулярно-массовое распределение  сдвигается в сторону больших  значений.

     Сравнивая результаты эксклюзионной хроматографии  и ЭФ-ПААГ, можно проследить общую  тенденцию увеличения доли конъюгатов при повышении мольного избытка  совиаля, т.е. повышение степени модификации. Более высокие значения для доли конъюгатов в ЭХр можно объяснить наличием в образцах олигомеров и полимеров IgG, которые в процессе хроматографии выходят в свободном объеме колонки (Mr>250кДа) вместе с химерными конструктами. В свою очередь более низкие значения для доли конъюгатов, полученные при анализе электрофореграмм указывают на гетерогенность конъюгатов по молекулярной массе, в результате чего часть химерных молекул, обладающая очень большим размером не входит в полиакриламидный гель, оставаясь в карманах концентрирующего геля.

     С помощью ЭФ-ПААГ в диссоциирующих-восстанавливающих  условиях можно заметить следующую закономерность: с увеличением мольного избытка изменяется соотношение тяжелой и легкой цепи в немодифицированных молекулах на электрофореграммах в сторону уменьшения доли тяжелой цепи. Это указывает на то, что связывание совиаля происходит в основном в области Fc-фрагмента. Тогда можно предположить, что раз Fab-фрагмент при модификации затрагивается в меньшей степени, то антигенсвязывающая функция при модификации может в той или иной степени сохраняться.

     Так или иначе, как показывают результаты анализа полученных химер в эксклюзионной  хроматографии и ЭФ-ПААГ в результате модификации образуются гетерогенная смесь, состоящая из немодифицированного  IgG и модифицированных производных с различными степенями замещения по реакционным группировкам, а также вероятно, содержащая конгломераты, содержащие агрегаты олигомерных и полимерных форм IgG, стабилизированные за счет перекрестного связывания посредством молекул совиаля.  
 
 
 

  3.4. Исследование свойств модифицированных форм специфического BIgG до и после термообработки

3.4.1. Влияние концентрации гентамицина на степень тепловой денатурации нативного и модифицированного BIgG

     Гентамицин (ГМ) добавляли для дестабилизации конформации IgG и усиления эффекта тепловой денатурации. О денатурации исследуемых образцов судили по изменению их мутности и вязкости или по желированию раствора в случае полной денатурации (сворачивания) макромолекул. Мутность и вязкость повышаются при агрегации и коагуляции молекул, так как при увеличении размеров частиц в растворе увеличивается светорассеяние и снижается скорость диффузии частиц.

     Нативный  и модифицированный IgG подвергали термообработке (пастеризации) без гентамицина и в присутствии гентамицина в концентрациях 5, 10, 15, 20 мг/мл. Без гентамицина и при концентрации гентамицина 5 мг/мл нативный IgG не желировался, как и остальные образцы, а при концентрации гентамицина 20 мг/мл произошло желирование всех образцов, кроме модифицированной формы 1/5. Поэтому измеряли вязкость и мутность для следующих образцов: нативная и модифицированные формы IgG нетермоинактивированные, термоинактивированные без гентамицина, термоинактивированные с гентамицином в концентрации 10 мг/мл, термоинактивированные с гентамицином 15 мг/мл. Результаты измерений представлены в таблицах 5, 6.