Методы медицинской генетики

Показания для цитогенетического  исследования:

1. Подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике (для подтверждения диагноза).

2. Наличие у ребёнка множественных врождённых пороков развития, не относящихся к генному синдрому.

3. Многократные (более двух) спонтанные аборты, мертворождения или рождения детей с врождёнными пороками развития.

4. Нарушение репродуктивной функции неясного генеза у женщин и мужчин (первичная аменорея, бесплодный брак и др.).

5. Существенная задержка умственного и физического развития у ребёнка.

6. Пренатальная диагностика (по возрасту, в связи с наличием транслокации у родителей, при рождении предыдущего ребёнка с хромосомной болезнью).

7. Подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью (учёт хромосомных аберраций и СХО).

8. Лейкозы (для дифференциальной диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза течения).

9. Оценка мутагенных воздействий (радиационных, химических).

Получение препаратов митотических хромосом

Первое главное  условие цитогенетической диагностики  — наличие делящихся клеток в цитологическом препарате. Культуры клеток можно получать из кусочков кожи (растут фибробласты), костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости. Наиболее удобным объектом для медицинских генетиков оказалась культура лимфоцитов периферической крови (рис. 8.2). Для её получения достаточно взять 1—2 мл венозной крови и добавить её в смесь питательной среды с фитогемагглютинином (белок бобовых растений). Последний вызывает иммунологическую трансформацию лимфоцитов и их деление. Продолжительность культивирования составляет 48—72 ч.

Вторым методическим условием цитогенетических исследований является использование колцемида (или колхицина), разрушающего веретено деления и останавливающего клеточное  деление на стадии метафазы Колцемид добавляют в культуры клеток за 2—3 ч до окончания культивирования: метафаз. Хромосомы в присутствии колцемида укорачиваются за счёт продолжающейся конденсации и, следовательно, в препарате они легче отделяются одна от другой.

В тех случаях, когда  необходим детальный анализ определённого района хромосомы, сильно конденсированные хромосомы на стадии метафазы (метод называется метафазным) непригодны для анализа. Для этих целей клетка должна быть зафиксирована на стадии, предшествующей метафазе, когда хромосома редуплицировалась, но ещё не полностью конденсировалась. Эта стадия — стадия прометафазы. Этот метод (или подход) в отличие от метафазного метода называют прометафазным, или методом высокоразрешающей цитогенетики. Суть методического вмешательства при данной модификации метода состоит в прекращении процесса спирализации и конденсации хромосом в профазе с помощью препаратов, которые вводят в культуру клеток за несколько часов до фиксации.

Следующим условием для получения хороших метафазных пластинок является гипотонизация клеток (гипотонический шок). Обычно для этого используют гипотонический раствор хлорида кальция или цитрата натрия. В гипотоническом растворе клетки набухают, ядерная оболочка разрывается, межхромосомные связи рвутся и хромосомы свободно плавают в цитоплазме.

Клеточную суспензию  фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты (3:1), затем суспензию центрифугируют и меняют фиксатор. Смесь клеток с фиксатором может сохраняться  при температуре 4 °С в течение  нескольких недель. При нанесении такой суспензии на чистое предметное стекло метафазная пластинка расправляется и в её пределах располагаются отдельно лежащие хромосомы. При высыхании фиксатора клетки прочно прикрепляются к стеклу.

Окраска препаратов

Следующая стадия цитогенетических методов — окраска препаратов. Все методы окраски препаратов можно разделить на 3 группы: простые, дифференциальные, флюоресцентные. флюоресцентные.

Наиболее распространён  метод окраски по Гимзе, или простая  окраска. Краситель Гимзы окрашивает все хромосомы равномерно по всей длине. При этом контурируются центромера, спутники и вторичные перетяжки.

Хромосомы способны к избирательному окрашиванию по длине без прижизненной модификации  какими- либо воздействиями. Дифференциальное окрашивание обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы. При этом выявляется структурная дифференцировка хромосом по длине, выражающаяся в виде чередования эу- и гетерохроматических районов (тёмные и светлые полосы). Каждая хромосома имеет свой рисунок исчерченности. При дифференциальной окраске метафазных хромосом в кариотипе можно оценить около 200—400 участков.

Первоначально при  специальном окрашивании хромосом использовали флюоресцентное алкилирующее вещество акрихин-иприт. Этот вариант был назван Q-методом. Данный метод требует быстрой обработки препарата, что не всегда удобно. Для просмотра препарата надо пользоваться люминесцентным микроскопом.

В последующем была разработана методика дифференциальной окраски без флюоресцентных красителей. Наиболее широко используется G-окраска (Гимза). При этом хромосомы предварительно обрабатывают (либо инкубация в солевом растворе, либо обработка протеазой). Предварительная обработка частично нарушает структуру хромосом, которая в некоторых участках восстанавливается при окраске, что и придаёт хромосоме индивидуальную исчерченность, или полосатость. 

Молекулярно-цитогенетические методы.

Благодаря успехам  молекулярной генетики человека разработан принципиально новый метод изучения хромосом — метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Принцип этого метода состоит в следующем.

1. Для изучаемой хромосомы или конкретного её участка готовят однонитевой участок ДНК, к которому присоединяется биотин или дигоксигенин. Такой «помеченный» участок ДНК называется зондом.

2. На микроскопическом препарате in situ при щелочной обработке хромосомная ДНК денатурируется, т.е. разрываются связи между двумя нитями ДНК.

3. Зондом обрабатывают препарат. Поскольку последовательность оснований ДНК-зонда и соответствующий участок хромосомы взаимно комплементарны, то зонд присоединяется к хромосоме. В этом участке происходит ренатурация ДНК.

4. После этого препарат обрабатывают веществом, которое благодаря своей структуре способно избирательно присоединиться к биотину или дигоксигенину. К этим веществам могут быть присоединены в один или два этапа флюоресцентные красители (родамин — красный цвет или флюоресцеин изотиоцианат — зелёный цвет).

5. С помощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы визуализируются на фоне неокрашенных.

Границы применения метода FISH очень широкие: от локализации  гена до расшифровки сложных перестроек между несколькими хромосомами.

Метод сравнительной геномной гибридизации (CGH— comparative genome hybridization). Область использования метода — онкологическая цитогенетика. Назначение метода — определение районов хромосом, которые делетируются или амплифицируются в определённом типе опухоли. Районы делеций, как правило, содержат гены-супрессоры опухолевого роста, а районы амплификации содержат онкогены.

Иногда бывает достаточно сложно получить хромосомные препараты  хорошего качества из солидной опухоли  или у больных с гематологическими  онко-заболеваниями, поэтому был  разработан оригинальный метод косвенного анализа хромосом в опухоли. Суть метода CGH в том, что из опухоли выделяют ДНК и метят её определённым флюорохромом. ДНК, выделенную из нормальной ткани, метят другим флюорохромом. Хромосомные препараты готовят стандартным способом из лимфоцитов периферической крови контрольного индивида. Меченую ДНК из опухоли и неизменённой ткани гибридизируют с хромосомным препаратом. По интенсивности свечения метки определяют области делеций и амплификации. Область разрешения — 5—10 млн пар нуклеотидов. Для обработки данных используют программы компьютерного анализа хромосом.

Спектроскопический  анализ хромосом {SKY). Этот метод использует флюоресцентные красители, имеющие сродство к определённым участкам хромосом. При использовании набора специфических зондов с разными красителями каждая пара хромосом имеет свои уникальные спектральные характеристики.

Особенность метода — использование интерферометра. Незначительные вариации в спектральном составе, неразличимые человеческим глазом, учитываются при компьютерной обработке, и затем программа назначает каждой паре хромосом легко распознаваемые цвета. Результат в виде цветного изображения чаще используется в цифровой форме. Анализ кариотипа значительно облегчается, поскольку гомологичные хромосомы имеют один и тоже цвет, а аберрации становятся легко различимыми. Кроме того, спектральное кариотипирование используется для выявления транслокаций, не распознаваемых традиционными методами.        Область использования метода — онкоцитогенетика. Благодаря такому подходу удаётся точно описать множественные структурные перестройки хромосом, происходящие в опухолевых клетках. 

Дерматоглифический  метод.

Собранный за долгие годы изучения материал позволяет использовать дерматоглифический метод (разработан Уайлдером в начале XX века) в современной  медицинской и генетической практике.

Понятия нормы и  патологии гребневых участков кожи позволяют врачам с уверенностью прогнозировать:

- вероятность наследственных заболеваний будущего потомства;

- возможные отклонения в развитии;

- различные генные мутации;

- врожденные дефекты развития (как частный случай — дефекты конечностей);

- гендерные аномалии (определение пола);

- летальные случаи;

- хромосомные заболевания (в т.ч. патологии головного мозга) и др.

Следует отметить, что  процесс формирования дермальных структур эмбриона укладывается в период 6–17 недель внутриутробного развития плода.

Весьма показательной  является практика выявления с помощью  дематоглифических методов болезни  Дауна. Согласно многолетним исследованиям, вероятность определения данной патологии достигает 95%-го рубежа. Начало этим исследованиям положил все тот же Гарольд Камминс.

Синдром трисомии по 18-й паре хромосом - синдром Эдвардса. К его характерным признакам  относятся скошенный подбородок, маленький рост, слаборазвитые челюсти, деформированные, низкостоящие асимметричные уши, пальцы рук иногда необычно длинные или, наоборот, очень короткие, с особым положением 2-го и 5-го пальцев, деформация стоп, короткая грудина, имеются дефекты сердечно-сосудистой системы и почек, глубокая дебильность. При дерматоглифическом исследовании характерно увеличение числа дуг на пальцах, единичная складка на мизинце и поперечная складка на ладони.

Большое количество дуг на пальцах наблюдается и  при синдроме трисомии - 89-й и 13-й  хромосом - синдром Патау (выпуклый лоб, задержка роста, заячья губа, волчья пасть, чрезмерная выпуклость ногтей на пальцах, умственная отсталость). 

Близнецовый метод. 

Близнецовый метод  был предложен Ф. Гальтоном в 1865 году, но окончательная разработка его основ была проведена Г. Сименсом в 1924 году. Сименс разработал надежный способ диагностики зиготности (метод полисимптомного сравнения), базирующийся на оценке сходства и различия близнецов по целому ряду параметров.

 Суть метода состоит в сравнении проявления признака в разных группах близнецов при учете сродства или различия их генотипов. Развитие признака у обоих близнецов называют конкордантностью. Если по определенным признакам между близнецами наблюдаются различия, то говорят о дискордантности. По определенным признакам близнецов подразделяют на монозиготных и дизиготных. Монозиготные близнецы развиваются в результате оплодотворения и деления одной яйцеклетки (при первом делении зиготы) на два самостоятельных генетически одинаковых индивида.

Дизиготные формируются  при одновременном созревании двух и более яйцеклеток с последующим оплодотворением их. Монозиготные близнецы генетически идентичны, общность генов у них составляет 100 %, и различия признаков зависят от внешних условий. Дизиготные по наследственным свойствам сходны между собой не более чем обычные братья и сестры, рожденные в разное время. Однако условия эмбриогенеза и внешней среды у дизиготных близнецов одинаковы. Признаки, отличающиеся у дизиготных близнецов, но тождественные у монозиготных, следует считать генетически детерминированными. Например, очень высокая степень конкордантности по олигофрении у монозиготных близнецов и относительно умеренная у дизиготных указывает на высокую степень наследственной предрасположенности к этому заболеванию. Одинаковые внешние условия и неполная идентичность генотипов (50 %) у дизиготных близнецов обеспечивают относительно низкую степень конкордантности по тем заболеваниям в возникновении, которых факторы среды играют второстепенную роль. Сходство показателя конкордантности у моно - и дизиготных близнецов свидетельствует о незначительной роли наследственных различий и определяющей роли среды в формировании признака или развитии заболевания. Так незначительная разница в конкордантности отмечена среди близнецов по заболеваемости инфекционными болезнями. Установление соотносительной роли наследственности и среды в развитии различных патологических состояний позволяет врачу правильно оценить ситуацию и проводить профилактические мероприятия при наследственной предрасположенности к заболеванию или осуществлять вспомогательную терапию при его наследственной обусловленности.