Методы медицинской генетики

Трудности метода.

Близнецовый метод  считается достаточно объективным  и чувствительным. Однако имеется  ряд трудностей связанных, во-первых, с относительно низкой частотой рождения близнецов в популяции. В среднем она равна 1,1-1,2 % всех рождений. Из них одна треть приходится на монозиготных близнецов, а две трети - на дизиготных. Однако в связи с несколько повышенной смертностью среди близнецов, по сравнению с таковой у одиночно рожденных, доля близнецов среди населения составляет всего 0,9 %. Это осложняет подбор достаточного количества пар с исследуемым признаком. Во-вторых, сложности возникают с идентификацией монозиготности близнецов. Распознавание моно - и дизиготности близнецов производится на основании сходства генетически детерминированных признаков - цвет глаз и кожи, цвета и формы волос, формы носа, губ, рта, форма и величена головы, ушных раковин, пальцев и кистей, особенности строения зубов, цвета их эмали, расположение веснушек, кожных сосудов, кожных узоров на пальцах и ладонях. Идентичность или очень близкое сходство является доказательством монозиготности.

Идентификацию близнецов  лучше проводить через несколько  лет после рождения, так как  в детском возрасте некоторые признаки недостаточно отчетливо выражены. В акушерской практике тип близнецов определяется по количеству (одна, две) околоплодной оболочек и плацент. Монозиготные близнецы, как правило, однополые, и если они развиваются в общем хорионе, то монозиготность доказана. Используются также методы, основанные на иммунологической идентичности близнецов по эритроцитарным антигенам и по сывороточным белкам. Наиболее достоверный критерий монозиготности предоставляет трансплантационный тест с применением перекрестной пересадки кожи близнецов. Несмотря на трудоемкость близнецового метода и возможность ошибок при определении монозиготности, высокая объективность выводов делает его одним из широко применяемых методов генетических исследований у человека. 

Биохимические методы.

Биохимические показатели (первичный белковый продукт гена, накопление патологических метаболитов  внутри клетки и во внеклеточных жидкостях  больного) отражают сущность болезни  более адекватно, чем клинические  симптомы, не только в диагностическом, но и в генетическом аспекте.

Объектами биохимической  диагностики могут быть моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные  элементы крови, культуры клеток (фибробласты, лимфоциты). При использовании просеивающего  метода в биохимической диагностике можно выделить два уровня: первичный и уточняющий. Основная цель первичной диагностики заключается в том, чтобы выявить здоровых индивидов и отобрать индивидов для последующего уточнения диагноза. Программы первичной биохимической диагностики наследственных болезней могут быть массовыми и селективными. Массовые просеивающие программы используются в диагностике фенилкетонурии, врождённого гипотиреоза, адреногенитального синдрома, врождённых аномалий развития нервной трубки и болезни Дауна.

Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать наследственные нарушения обмена аминокислот, олигосахаридов и гликозаминогликанов (мукополисахаридов). Газовая хроматография применяется для выявления наследственных болезней обмена органических кислот. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируется вся группа гемоглобинопатии.

В современных условиях очень многие этапы биохимической  диагностики осуществляются автоматическими  приборами, в частности аминоанализаторами.

Реальным примером программы селективного скрининга на наследствен- ные болезни обмена веществ с острым течением и ранним летальным исходом является программа, разработанная в Медико-генетическом научном центре РАМН.

Первый этап программы  включает качественные и количественные тесты с мочой и кровью A4 тестов) на белок, кетокислоты, цистин и гомоцистин, креатинин, ионы аммония и др. Второй этап основан на методах тонкослойной хроматографии мочи и крови для выявления аминокислот, фенольных кислот, моно- и дисахаридов и других соединений. С помощью электрофореза мочи выявляют гликозаминогликаны.

Показаниями для  применения биохимических методов  диагностики у новорождённых  являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический  запах мочи и пота, ацидоз, нарушенное кислотно-основное состояние, остановка роста. У детей биохимические методы используются во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена веществ (задержка физического и умственного развития, потеря приобретённых функций, специфическая для какой-либо наследственной болезни клиническая картина).

Биохимические методы применяются для диагностики  наследственных болезней и гетерозиготных состояний у взрослых (гепатолентикулярная  дегенерация, недостаточность сс,-антитрипсина, недостаточность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и т.д.).

Просеивающий  метод.

Экспресс-методы —  это быстрые предварительные  методы изучения генетики человека. Они  часто используются для исследования больших контингентов людей с  целью выявления наследственной патологии как скрининг-методы, применяемые при проведении просеивающих программ. Например, скрининг новорожденных на фенилкетонурию, гипотиреоз, беременных на альфа-фетопротеин, при помощи которого можно пренаталь-но определить у плода некоторые пороки развития (например, анэнцефалию, открытые формы спинномозговых грыж, синдром Дауна).

К этим методам предъявляются  определенные требования:

1) метод должен  быть диагностически значимым, то  есть положительные и отрицательные  результаты должны соответствовать  наличию или отсутствию заболевания;

2) метод должен  быть надежным: один и тот же  образец при независимой двукратной  проверке должен одинаково оцениваться; 

3) исследованию должен  подвергаться легкодоступный материал (кровь, моча) в малых количествах  (например, пятна капиллярной крови, высушенной на фильтровальной бумаге);

4) метод должен  быть приемлемым для обследуемых,  исполнителей и врачей;

5) метод должен  быть экономичным. 

Микробиологический  ингибиторный тест Гатри позволяет  выявлять некоторые биохимические  нарушения у новорожденных. Из пятки новорожденного берут кашпо крови на диски фильтровальной бумаги, которые помещают на агаровую культуру В. subtillis. Последнюю выращивают на минимальной питательной среде, содержащей антиметаболит искомой аминокислоты (например, фенилаланина). Антиметаболит должен одновременно тормозить рост микроба. При наличии в крови младенца большого количества фенилаланина антиметаболит разрушается и микробы начинают бурно расти. Меняя антиметаболиты, можно диагностировать наличие в крови определенных аминокислот и углеводов (лейцина, гистидина, фруктозы, галактозы и др.).

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Молекулярно-генетические методы — большая и разнообразная  группа методов, в конечном счёте  предназначенных для выявления  вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов  лежат «манипуляции» с ДНК и РНК.

1. Получение образцов  ДНК (или РНК) является исходным  этапом всех методов. Этот этап реализуется в двух вариантах: а) выделение всей ДНК (тотальной или геномной) из клеток; б) накопление определённых фрагментов, которые предполагается анализировать, с помощью ПЦР.

В большинстве случаев  для успешной диагностики болезни  или гетерозиготного состояния достаточно исследовать лишь небольшой фрагмент генома, поэтому для проведения анализа необходимо получить достаточное количество таких фрагментов, т.е. амплифицировать (умножить) их. Эта задача — накопление нужных фрагментов ДНК — решается с помощью ПЦР.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод амплификации ДНК in vitro.

Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемого фрагмента или по крайней мере этого фрагмента. В соответствии с нуклеотидной последовательностью концов исследуемого участка синтезируется два олигонуклеотидных праймера (затравки). Длина праймеров составляет 20—30 пар нуклеотидов.

Процесс амплификации заключается в осуществлении  повторяющихся циклов. Каждый цикл включает 3 стадии: температурная денатурация ДНК (разделение двухцепочечной ДНК на одноцепочечные молекулы) -> присоединение праймеров к комплементарным последовательностям одноцепочечных молекул (отжиг) -> синтез полинуклеотидных цепей на одноцепочечных молекулах в границах присоединенных праймеров с помощью полимеразы.

2. Рестрикция ДНК на фрагменты. Этот процесс осуществляется рестриктазами, относящимися к группе бактериальных эндонуклеаз. Основное их свойство — разрывать двухцепочечную ДНК в пределах строго определённых для каждого фрагмента последовательностей нуклеотидов протяжённостью 4—6 пар нуклеотидов (редко больше).

3. Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещённом в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному.После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определённое положение.

4. Визуализация и  идентификация фрагментов ДНК в геле является либо конечным этапом диагностики, либо необходимым элементом дальнейшего анализа.

После окончания  ПЦР проводится электрофорез в агарозном  геле, после чего гель обрабатывается этидия бромидом, который связывается  с ДНК. При ультрафиолетовом облучении поверхности геля выявляется свечение в красной области спектра.

Прямые методы.

Принципиально различают  прямую и косвенную ДНК-диагностику  моногенных наследственных болезней. Прямые методы возможны лишь при условии, что ген заболевания клонирован, известна его экзон-интронная организация или нуклеотидная последовательность полноразмерной комплементарной ДНК. При прямой диагностике предметом анализа являются мутации гена. Главным преимуществом прямых методов диагностики является почти 100% эффективность.

Методы, основанные на технологии ПЦР. В общем случае секвенирование полноразмерной кДНК, или всех экзонов, для определения мутаций у отдельных пациентов достаточно трудоемко, дорого и требует больших затрат времени. Поэтому на практике чаще проводят предварительный отбор более простыми методами амплификации фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации, а затем секвенируют только эти участки ДНК. Методы поиска фрагментов ДНК, содержа-щих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных последовательностей по целому ряду физических и химических характеристик. Разница в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет легко идентифицировать мутации при электрофорезе.

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) — метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК — основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организации молекул.

Ограничением применения этого метода является размер исследуемого фрагмента ДНК, так как высокая  эффективность детекции мутаций, составляющая 80—95%, показана при длине фрагментов менее 200 пар нуклеотидов, в то время  как для фрагментов более 400 пар  нуклеотидов вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.

DGGE — денатурирующий  градиентный гель-электрофорез. В этом методе ДНК-дуплексы подвергаются миграции в геле с градиентом денатурирующих условий (может быть использован и температурный градиент). Миграция продолжается до тех пор, пока ДНК-дуплексы не достигают в геле точки плавления и не разделяются, после чего миграция фрагментов останавливается. Однонуклеотидные различия в нормальной и тестируемой ДНК выявляются по различной электрофоретической подвижности в геле.

ССМ (chemical cleavage of mismatch) — метод химического расщепления неспаренных оснований. Метод основан на гибридизации радиоактивно меченной ДНК-пробы с тестируемой ДНК. Места ошибок затем выявляют с помощью серии химических реакций (модификация с использованием тетрахлорида осмия), которые происходят с однонитевой ДНК в сайтах неправильного спаривания.

Заключительным этапом анализа мутаций является их секвенирование, т. е. определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, показавшего аномальную электрофоретическую подвижность. Последовательность нуклеотидов этого фрагмента сравнивается с нормой, в результате чего патология приобретает свою окончательную характеристику.

Популяционно-генетический метод.

Методы, используемые для установления частот генов и генотипов в популяции, демонстрирующие характер их изменения под влиянием окружающей среды и различных факторов популяционной динамики, носят название популяционно-статистических.  

С помощью этих методов  можно:

• определить частоты генов, степень гетерозиготности и полиморфизма,

• установить, как  меняются частоты генов под действием  отбора,

• выявить влияние  факторов популяционной динамики на частоты тех или иных генотипов  и фенотипов,

• проанализировать влияние факторов внешней среды на экспрессию генов,