Сахарный диабет

Рисунок 1. Способы регистрации  глюкозооксидазной реакции

 

 

 

 

 

 

 

 

Среди вышеперечисленных способов регистрации наибольшее распространение  получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-радикала – О₂^-, который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена.

 

 

 

На представленных ниже графиках показаны спектры рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы и после. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе. 

График 1. Спектр рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы

График 2. Спектр рабочего раствора после внесения в него стандартного раствора глюкозы

 

Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется  его высокой специфичностью и  простотой выполнения. Метод можно  реализовать как с применением  обычного фотометра так и с  помощью автоматических биохимических автоанализаторов.

 

Глюкозооксидазный метод  признан сегодня одним из самых  точных количественных методов определения  глюкозы. В качестве биологического материала используется как сыворотка  крови, так и цельная кровь. При  работе с последней следует учитывать  тот факт, что при взятии капиллярной  крови доля сыворотки (плазмы) зависит  от величины гематокрита, что может  негативно отразиться на точности результата. Поэтому при определении глюкозы  вышеописанным методом предпочтительно  использовать сыворотку крови пациента.

 

Измерение глюкозы крови  с помощью глюкометра.

Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет  назад появились наборы, в которых  реализован кинетический метод фотометрирования. Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени. Этот метод требует применения кинетического фотометра, полуавтоматических анализаторов, или  автоматических биохимических анализаторов. Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением и она может служить источником заряженных частиц. Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.

Рисунок 2. Схема  измерительной ячейки

 

 

 

 

 

 

 

 

В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной. На мембрану толщиной около 60 микрон специальным образом  сорбирована глюкозооксидаза. С  другой стороны мембраны к ней  прижимается платиновый электрод.

 

Проба цельной крови (обычно 20 мкл) разводится в системном буферном растворе (эритроциты разрушаются), после  чего подается по магистрали в проточную  ячейку. Глюкоза, подвергается окислению  под воздействием фермента глюкозооксидазы, находящейся на мембране. Образовавшаяся перекись водорода диффундирует через  мембрану и окисляется далее в  каталитической реакции под действием  платины. Диффузия перекиси водорода на поверхность платины формирует  ток, пропорциональный числу молекул Н₂О₂. Полученный таким образом сигнал обрабатывается прибором в соответствующее значение напряжения. Это измеренное значение пропорционально концентрации глюкозы в пробы.

 

Важным этапом в развитии методов  клинической лабораторной диагностики  стало появление «сухой химии». Естественно, одним из первых приложений этой технологии стала задача определения глюкозы в крови пациента. Первые приборы значительно уступали по точности традиционным лабораторным методам исследований. Однако, со временем, ряду фирм удалось разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры, которые обеспечили весьма высокую точность анализа. Широко популярными во всем мире в настоящее являются глюкометры One Touch и тест-полоски к ним производства компании Life Scan (США), которые удачно сочетают в себе аналитическую точность количественного ферментативного метода со скоростью и простотой «сухой химии».

 

Глюкометры One Touch предназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови. Тест-полоска One Touch содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Результатом реакции является образование окрашенного комплекса. Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.

Рисунок 3. Конструкция тест-полоски

 

 

 

 

 

Мембрана тест-полоск One Touch напоминает губку с микроскопическими порами и выполняет тройственную функцию. Она действует: 1) как резервуар, собирая необходимое количество крови, 2) как фильтр, блокируя твердый клеточный материал (эритроциты, лейкоциты и др.), 3) как гладкая оптическая поверхность, на которой измеряется отраженный свет. Последняя функция, в частности, очень важна для работы прибора. Она делает возможным считывать нижнюю часть полоски, тогда как кровь остается на верхней части тест-полоски. Соответственно, нет необходимости стирать (промокать) кровь с поверхности тест-полоски.

В дополнении к этому, мембрана обладает гидрофильными свойствами, благодаря  которым капля крови “притягивается”  к поверхности тест-полоски при  касании.

В состав приборов One Touch входит два специальных светодиода. Обработка развившейся окраски на тест-полоске идет следующим образом. Как только тест-полоска вставлена в прибор – происходит нулевое считывание. В этот момент на дисплее мы видим: “ЖДАТЬ”. Когда капля крови наносится на тест-полоску, плазма крови моментально сорбируется мембраной, тогда как эритроциты и излишки плазмы остаются на поверхности мембраны. После полного впитывания капли крови немедленно происходит окрашивание. Прибор регистрирует изменение величины отражения и автоматически запускает таймер. Через 45 секунд химическая реакция заканчивается, результат светоотражения обрабатывается. Окрашенный продукт реакции поглощает свет, испускаемый первым светодиодом. Форменные элементы крови и лишняя плазма также поглощают свет, излучаемый диодом. Чтобы скорректировать фоновое отражение, второе считывание производится вторым светодиодом на другой длине волны. Разность сигналов от первого и второго светодиода несет информацию о поглощении света хромогеном. Сигнал, полученный от хромогена для оценки концентрации глюкозы, соотносится со специальной калибровкой. Все приборы One Touchоткалиброваны с использованием референтного метода на лабораторном анализаторе глюкозы. С помощью этой процедуры получается стандартная калибровочная кривая. Отметим, что достаточно сложно наладить производство тест-полосок, которые были бы абсолютно одинаковыми химически, в силу очень низкой концентрации реактивов. Для решения этой проблемы используется стандартная калибровочная кривая, состоящая из 16 –ти калибровочных линий. Контроль качества осуществляется сразу после производства тест-полосок, что позволяет определить, какая из калибровочных линий (от 1 до 16) может быть применена для данной тест-полоски. Это так называемый номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок. Эти 16 калибровочных линий также программируются в микропроцессоре прибора. Для получения оптимально точных результатов, номер кода, указанный на упаковке тест-полосок выставляется в приборе при помощи кнопки кода. Таким образом, неправильно установленный код на приборе может являться причиной ошибки измерения.

Гексокиназный метод

Гексокиназный метод состоит  из двух последовательных реакций, но совершенно других:

  

Регистрация осуществляется при длине  волны 340 нм по светопоглощению НАДН. Этот метод является высокоспецифичным  и не дает реакции с другими  компонентами сыворотки крови. Гексокиназный  метод считается референтным  для определения глюкозы. Как  правило, он линеен до 50 ммоль/л, что  позволило его широко рекомендовать  для клиник с эндокринологическими отделениями.

 

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Определение концентрации глюкозы в крови глюкозооксидазным  методом с использованием традиционного  методического подхода, связанного с применением сертифицированного набора реагентов.

 

Исследование концентрации глюкозы  в сыворотке крови проводилось на базе клинико-диагностической лаборатории Учреждения здравоохранения «Несвижская центральная районная больница» Минская область, г.Несвиж, ул.Сырокомли, 29.

 

Для исследования было задействовано  15 пациентов из числа обратившихся в лечебно-профилактическое учреждение Учреждение здравоохранения «Несвижская центральная районная больница».

Пациенты А (А1, А2, А3, А4, А5) не име ют ни одного из симптомов СД

Пациент В (В1, В2, В3, В4, В5) болеют ИЗСД

Пациент С (С1, С2, С3, С4, С5) болеет ИНЗСД

 

Методическое  руководство: инструкция по применению набора реагентов для определения глюкозы (без депротеинизации). Фотометрический глюкозооксидазо-пероксидазный метод.

Реагенты:

Таблица 1. Состав ферментного реагента:

Фосфатный буфер (рН 7,5)	0,1 моль/л
4-аминофеназон	0,25 ммоль/л
Глюкозооксидаза	> 15 КЕд/л
Пероксидаза	> 1,5 КЕд/л
Мутаротаза	>2,0 КЕд/л
Фенол	0,75 ммоль/л
Стабилизаторы

 

Таблица 2. Состав стандартного реагента

Глюкоза

5,55 ммоль/л

Оборудование: Пробирки Эпиндорфа, центрифуга, дозаторы полуавтоматические на 1000 мкл и 10 мкл,  спектрофотометр Solar PA2600, кюветы полистироловые одноразовые с длиной оптического пути 1 см.

Принцип метода: Глюкоза в присутствии глюкозооксидазы ферментативно окисляется. Индикатором является Хинонеимин, который образуется из перекиси водорода и 4-аминофеназона в присутствии фенола и пероксидазы.

 

 

 

 

 

Подготовка  и стабильность реагентов: Ферментный реагент и стандарт готовы к применению. Линейность до 22,2 ммоль/л или 400 мг/дл. При такой концентрации глюкозы и выше, пробу необходимо разбавить дистиллированной водой в соотношении 1:2 и результат умножить на 3. Допускается использование контрольных сывороток, концентрация глюкозы в которых аттестована данным методом.

Диапозон  референтных величин: сыворотка, плазма крови (натощак) 4,2-6,4 ммоль/л или 75-115 мг/дл.

Исследуемый материал: сыворотка крови.

Ход работы:

1. У пациентов групп А, В и С была отобрана капиллярная кровь натощак с соблюдением требований санитарного противоэпидемического режима. Пробирки Эпиндорфа с пробами от пациентов А, В и С промаркированы соответственно А1-А5, В1-В5, С1-С5.
2. Пробы процентрифугированы при скорости 1500 об/мин 5 минут.

Таблица 3. Схема пипетирования

	Опытная проба	Стандартная проба	Холостая пробы
Исследуемая  проба	10 мкл
Стандартный раствор		10 мкл
Ферментный реагент	1000 мкл	1000 мкл	1000 мкл

 

3. Перемешать и инкубировать в течении 5 минут при 37^оС. Так как в используемом спектрофотометре термостат встроенный мы не используем дополнительного оборудования.
4. После инкубирования раствор с холостой пробой не изменил цвет, со стандарной пробой изменился цвет на красный и с опытными пробами также изменился цвет на красный.
5. Измеряем оптическую плотность растворов при длине волны 500нм против холостой пробы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

6. Результат. Так как спектрофотометр Solar PA2600 является полуавтоматическим и позволяет вносить параметры фотометрирования до проведения анализа, мы получаем в результате не оптическую плотность растворов, а концентрацию глюкозы в растворах. Для получения результатов калибровки нет необходимости построения калибровочной кривой, так как согласно сертифицированной инструкции мы имеем длину волны, а благодаря наличию стандартного раствора мы можем получить фактор пересчета, который и будет записан в программу спектрофотометра для автоматического подсчета концентрации глюкозы.

 

Таблица 4. Результаты первого  исследования уровня глюкозы

	Стандарный раствор	Группа А	Группа В	Группа С
1	5, 56 ммоль/л	4,7 ммоль/л	13,1 ммоль/л	7,9 ммоль/л
2		4,1 ммоль/л	13,4 ммоль/л	6,8 ммоль/л
3		5,3 ммоль/л	9,8 ммоль/л	7,3 ммоль/л
4		4,8 ммоль/л	10,1 ммоль/л	8,9 ммоль/л
5		5,0 ммоль/л	15,6 ммоль/л	8,5 ммоль/л