Техника изготовления гистологических препаратов

Техника изготовления гистологических  препаратов

Взятие  материала для  изготовления гистологических  препаратов

Существует  несколько путей получения материала:

1. От животных, умерщвленных специально для этих целей;
2. От животных и людей в результате прижизненного оперативного иссечения кусочков тканей из органов живого организма (биопсия);
3. Взятие материала от трупа.

Первые  два способа позволяют приготовить  препараты, наиболее полно отражающие прижизненное состояние микроструктур. Качество трупного материала находится в прямой зависимости от времени, прошедшего с момента смерти организма, так как в органах и тканях очень скоро начинают развиваться посмертные изменения.

Умерщвление экспериментальных  животных

Существует  несколько методов умерщвления  экспериментальных животных: отсечение  головы (декапитация), умерщвление при  помощи наркоза, пропускание электрического тока через тело животного, введение в кровеносное русло воздуха  или в плевральную полость эфира.

Выбор метода диктуется видом животного  и целями исследования .

Вскрытие  лабораторных животных

После умерщвления тело животного быстро фиксируют в положении на спине. Лягушек, тритонов, мышей и других мелких лабораторных животных фиксируют  на дощечках, восковых или пробковых  пластинках, прикалывая за растянутые в стороны лапки.  Для фиксации средних и крупных лабораторных животных используют специальные станки или же изготовленные для этих целей доски (оцинкованные или окрашенные с вбитыми по краям крючками или гвоздиками для привязывания конечностей).

Техника вскрытия брюшной и грудной полостей для всех лабораторных животных одинакова .  Однако у животных, имеющих шерстяной покров, вначале следует иссечь достаточно широкий кожный лоскут, чтобы избежать загрязнения внутренних органов .  Для этого, захватив и приподняв (с помощью хирургического пинцета)  кожу нижней части стенки живота по средней линии, подрезают ножницами образовавшуюся складку по направлению к голове, срезая кожный лоскут на нужном протяжении.

Затем следует сменить ножницы (или  очистить их от прилипшей шерсти) и удалить влажным тампоном шерсть, попавшую на образовавшуюся                « дорожку».

Вскрытие  брюшной полости. Нижнюю часть стенки живота приподнимают пинцетом по средней линии, прорезают ножницами вход в брюшную полость, вводя туда одну из браншей (но обязательно тупую) и разрезают стенку кверху до грудины. Затем берут кровоостанавливающие зажимы, захватывают ими внутренние слои стенки живота вместе с брюшиной и отворачивают кнаружи,  раскрывая брюшную полость.

Вскрытие  грудной полости. Вскрытие производится двумя разрезами через реберные хрящи по обе стороны от грудины снизу вверх.  Образовавшийся костно - хрящевой  лоскут удаляют.

У мелких  лабораторных животных следует вскрывать  одновременно брюшную и грудную  полости для обеспечения достаточно свободного доступа к внутренним органам, у крупных же вскрывать  только ту полость, откуда необходимо брать органы для исследования.

Взятие  и этикетирование  материала.

Главными  требованиями при взятии материала  являются: максимальное

сокращение  сроков взятия, минимальное травмирование тканей, создание оптимальных условий для фиксации.

При иссечении  материала необходимо максимально  бережно обращаться с тканями: участки  органа, подвергшиеся травмированию, не следует оставлять для исследования.

Благоприятные условия для фиксации создаются правильным выбором размера фиксируемого материала,  ибо необходимо обеспечить равномерное и сравнительно быстрое проникновение фиксирующей жидкости во всю его толщину.  Поэтому нужно вырезать кусочки толщиной не более 5-10мм. Поперечный же и продольный размеры не имеют столь важного значения и определяются задачами исследования.

Если  орган состоит из участков, различных  по своему строению, необходимо производить разрез таким образом, чтобы все они попали в кусочек , а при невозможности – брать кусочки отдельно с каждого участка.

Особые  приемы требуются для взятия материала, имеющего строение пленок, и из полых  мышечных органов, выстланных слизистой  оболочкой, так как пленки в фиксирующей жидкости сморщиваются , а стенка полого органа после разрезания вследствие сокращения мышечной оболочки  изгибается дугообразно слизистой оболочкой наружу. Поэтому прежде чем брать такой материал, необходимо ванночку или стеклянную чашку с плоским дном залить расплавленным воском так,  чтобы толщина покрытия ровнялась 1,5 -2 см , и дать ему остыть .  следует также приготовить иглы для накалывания, фиксирующие жидкости и лишь после этого приступить к взятию материала.

Вместо  восковых подушек для накалывания  препаратов можно применять пробковые  пластинки, которые для удаления из них тонина (дубящее вещество) следует предварительно несколько  раз прокипятить в воде и хранить  в 70-80% спирте, а также кусочки  картона.

Фиксация 

Цель  фиксации – сохранить прижизненное состояние клеток и тканей. Достигается  это путем быстрой коагуляции белков и стабилизацией липидов  при взаимодействии тканей с фиксирующими жидкостями. Процессы  клеточного метаболизма  при этом прекращаются. Предотвращается  аутолиз клеток и формирование посмертных изменений в тканях. Эта же цель может быть достигнута замораживанием с последующим изготовлением срезов на замораживающем микротоме.

Под влиянием фиксаторов тканевые структуры всегда деформируются. Они могут набухать или, чаще, сжиматься, уплотняться. Это  в дальнейшем отражается на оценке состояния органа и постановке диагноза .  промежуток времени между иссечением образца органа или ткани и погружении его в фиксирующую жидкость , должен быть минимальным.

Увеличение  этого промежутка может привести к подсыханию поверхностных слоев  клеток, нарушению их структуры и  формированию артефактов.

Объем фиксирующей жидкости должен превышать  объем материала в 10-15 раз.  Если  одновременно фиксируется большое количество образцов, то желательно переслаивать их скомканными кусочками марли.  Можно каждый образец завязывать в марлевый мешочек.  Это позволяет фиксатору проникать внутрь равномерно, по всей поверхности кусочка.

Если  после погружения образцов фиксатор меняет окраску или мутнеет, то его  необходимо срочно заменить свежей порцией.  Не допускается повторное применение фиксирующей жидкости.  Сроки фиксации различны и зависят от выбора фиксатора и условий фиксации.

В качестве фиксаторов используют простые жидкости  (формалин, этиловый спирт, ацетон) и  фиксирующие смеси (жидкость Карнуа, жидкость Ценкера).

Наиболее  широко применяется недорогой фиксатор формалин (40% раствор формальдегида).  Формалин легко диффундирует в ткани, применим для общих и для многих специальных и гистохимических методов окраски.  Критерием достаточной фиксации является равномерное уплотнение и обесцвечивание образца на контрольном разрезе.

Если  материал переуплотнился в результате длительной фиксации, его можно размягчить, поместив  в 10% раствор лимонной кислоты.

Перед употреблением формалин необходимо нейтрализовать. Для этого его настаивают на мелу или углекислом основном магнии из расчета 100 и более граммов нейтрализатора на 1 л неразведенного формалина.

До настоящего времени широко применяют рецепты  изготовления  формалиновых фиксирующих  растворов, изложенных в классическом пособии Р. Лилли:

1. 10% формалин

37-40%  раствор формальдегида 100мл

Водопроводная вода                    900мл

2. Нейтральный 10% формалин

37-40%  раствор формальдегида 100мл

Дистиллированная  вода               900мл

Карбонат  кальция или магния в избытке

3. Забуференный нейтральный раствор формальдегида

37-40%  раствор формальдегида 100мл

 Дистиллированная вода               900мл

Однозамещенный  фосфат натрия   4г 

Безводный двузамещенный фосфат натрия 6,5 г

В качестве фиксирующей жидкости можно применять 80-100% этиловый спирт.  По сравнению с формалином спирт обладает меньшей проникающей способностью , но вызывает резкую коагуляцию белков. Хранить кусочки в этаноле не желательно, так как они при этом переуплотняются, пересушиваются.  Фиксация этанолом предпочтительна при исследовании содержания и распределения в тканях гликогена, железа, амилоида.