Биотехнология

Методы выделения кариопластов несколько сложнее и включают в себя ряд операции по центрифугированию, разделению в градиенте плотности и т.д. В некоторых случаях к смеси клеток и кариопластов добавляют частицы тантала диаметром 1 – 3 мкм. Они проникают в клетки и никогда в кариопласт, поэтому более тяжелые клетки осаждаются быстрее кариопластов.

Цитопласты содержат все виды органелл, присущие нормальной клетке, сохраняют способность прикрепляться к субстрату, образовывать складчатую мембрану, передвигаться, осуществлять пиноцитоз.

Кариопласты окружены тонким слоем цитоплазмы (около 10% от всей клеточной цитоплазмы), содержат компактный эндоплазматический ретикулум, несколько митохондрий и рибосом. У некоторых клеточных линий 1/10 кариопластов способна восстановить весь утраченный объем цитоплазмы и восстановиться в жизнеспособные клетки.

Для реконструкции клеток суспензию кариопластов в солевом буфере добавляют к монослою культуры цитопластов из пропорции 100 кариопластов на 1 цитопласт. Цитопласты должны быть уже покрыты инактивированными вирусными частицами. Инкубируют при температуре 4оС 45 минут, а затем еще 45 минут при температуре 37оС. Отмывают раствором Эрла для удаления не слившихся кариопластов.

Американские исследователи С. Стик и Дж. Робл, используя методику МакГрата и Солтера, в 1988 г. получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8 клеточных эмбрионов одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора. В этих экспериментах только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически идентичных животных. Ценность этой работы тем не менее в том. что она показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.

Первые успешные эксперименты по клонированию сельскохозяйственных животных были проведены С. Уилладсином (S.Willadsen) в 1986 г. Он сливал безъядерные яйцеклетки с бластомерами, выделенными из 8 и 16-клеточного эмбриона овцы.

Дж. Робл и его сотрудники в1987 провели работы по пересадке ядер крупного рогатого скота. Они пересаживали в зиготы кариопласты - мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2, 4 или 8-клеточных эмбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в энуклеированную зиготу.

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструированные зародыши в этой работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. Два зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку коровы, и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы.

Позже были и более успешные работы. С. Уиладсин (1989), в частности. сообщил, что ему удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-клеточного зародыша. Автор утверждал, что большинство ядер сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы. После пересадки в матку коров - окончательных реципиентов, как полагает автор, они могут и дальше нормально развиваться.

К. Бондиоли и соавторы (1990), используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.

Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены.

Экспериментов по клонированию свиней немного. Успешные исследования провели Р. Пратер с сотрудниками в 1989 г. Скудность данных, видимо, связана с определенными трудностями работы с этим объектом.

в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Я. Уилмута (Ian Wilmut) из Рослинского института получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.

Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые использовали эмбриональные и фибробластоподобные клетки плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода - на 4-6-м пассажах и клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии G0 и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Был использован метод электрослияния. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе.

Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты плода - для двух и эмбриональные клетки - четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента. Анализ генетических маркеров подтвердил этот результат.

Успех авторов этой работы прежде всего связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.

Аналогичные эксперименты проводили позднее Tanja Dominko и сотрудники лаборатории Висконсинского университета, которые обеспечили клонирование эмбрионов из клеток кожи ушей взрослого рогатого скота. Эмбрионы, генетически идентичные корове, пожертвовавшей клетки уха, были внедрены в матки коров - рецепиентов. Наблюдалась постепенная гибель эмбрионов, поэтому жизнеспособных телят не получили. Причины пока не установлены.

В августе 1997 года появилось сообщение о том, что Алан Троунсон (Австралия) разработал технологию, которая позволяет сформировать эмбрион из 16, 32 или 64 клеток и затем каждая из них может использоваться для формирования 16, 32 или 64 идентичных эмбрионов. Коллектив исследователей во главе с Аланом Троунсоном создал 470 генетически идентичных эмбрионов рогатого скота от единственной бластоцисты. Такая технология обеспечивает безграничный источник генетического материала для клонирования.

Несмотря на отсутствие немедленных практических результатов сделанного открытия, теоретическую значимость его трудно переоценить. Впервые было доказано, что гены запрограммированы обратимо. Дальнейшие исследования могут позволить понять, как регулируется работа генов, дифференциация клеток, почему клетки в одних случаях растут и размножаются управляемо, а в других (при раке) - неконтролируемо.

Уже сейчас корпорация Genzyme Transgenics планирует исследования с целью создания трансгенного крупного рогатого скота, содержащего в молоке человеческий альбумин. Был куплен патент на получение эмбрионов, содержащих геном клеток соединительной ткани (фибробластов), включающий ген, ответственный за синтез человеческого белка. Несколько коров в настоящее время беременны трансгенными телятами. Подобная технология позволяет увеличить эффективность создания трансгенных молочных животных, так как при обычном впрыскивании генов в оплодотворенную яйцеклетку рождается только 5 - 10% трансформированных животных, из них - несколько самцов, не дающих молока. Использование новой технологии клонирования позволяет получать животных только женского пола, дающих трансгенный протеин.

Трансплантация эмбрионов.

Трансплантация эмбрионов в настоящее время является одной из наиболее актуальных проблем в области животноводства. С помощью пересадки эмбрионов можно резко увеличить выход числа потомков от высокопродуктивных коров. Трансплантация эмбрионов, или эмбриотехнология, заключается в получении одного или нескольких эмбрионов из матки племенных животных (доноров) и пересадке в матку коров (рецепиентов), где эмбрионы развиваются до отела. Этот метод в сочетании с суперовуляцией у доноров позволяет получить большое потомство от высокопродуктивных животных. Этим способом эмбрионы можно внедрить в ту или иную породу в другие регионы, используя в качестве рецепиентов коров мясных пород. Применение этого метода также упрощает обмен генофондом сельскохозяйственных животных между странами и континентами. Пересадка эмбрионов может быть использована для получения потомства от ценных, но бесплодных коров, утративших способность к размножению в результате несчастного случая, болезни или по возрасту.

Когда было установлено, что кролик обладает иммунитетом по отношению к ящуру, была выдвинута идея использования метода трансплантации для оздоровления потомства зараженных ящуром животных. Половые пути кролика, куда трансплантируются эмбрионы, способны разрушать вирус ящура в эмбрионах. Трансплантация может быть использована и для временного хранения эмбрионов. В яйцеводах крольчих удается осуществлять трансконтинентальную перевозку эмбрионов овец.

Извлечение эмбрионов до 70-х годов производили в основном хирургическим путем, впоследствии он был заменен менее травматичным и трудоемким нехирургическим, основанным на введении в матку особого зонда по естественному каналу. Зонд имеет три канала. Один из каналов предназначен для надувания баллончика, который закупоривает рог матки, препятствуя вытеканию жидкости. По другому каналу вводится физиологический раствор с температурой 25-30оС, который вымывает эмбрионы и возвращается вместе с ними  через третий канал зонда в пробирку, помещенную в водяную баню с температурой 35оС. Из этой жидкости извлекаются эмбрионы. В среднем при суперовуляции от донора можно получить от 5 до 7 эмбрионов.

Трансплантацию производят с помощью специального зонда или пистолета для осеменения. Эмбрионы помещаются в рога матки. Стельность у самок - рецепиентов проверяется по уровню прогестерона в плазме крови на 21-й день.

Регулирование пола. В практике разведения животных очень важно научиться управлять образованием в потомстве мужских и женских особей. Метод разделения эмбрионов по полу основан на определении белков, специфичных для самцов. Этом метод широко применяется в животноводческой практике многих стран.  В Канаде уже с 1975 года рождаются телята, разделенные по полу на стадии эмбрионов. В перспективе для целенаправленного получения особей мужского или женского пола может быть применен метод микрохирургической замены Х и У хромосом. Такие манипуляции уже проводились на растительных клетках и яйцеклетках земноводных.

7. Этапы получения трансгенных животных. Создание разных типов трансгенных животных.

Современные методы селекции сельскохозяйственных животных базируются на использовании внутривидовой генетической изменчивости. Как правило, виды генетически изолированы друг от друга и не скрещиваются между собой, так как этому препятствует репродуктивная изоляция. В классической селекции, где используют для скрещивания животных с половой совместимостью, нельзя применять межвидовую генетическую изменчивость и создавать новые генетические формы, так как рекомбинация генов происходит только между хромосомами животного одного вида.