Биотехнология

Преодолеть биологические границы видов и использовать межвидовую генетическую изменчивость для создания новых форм животных можно с помощью переноса генов.
Под переносом чужеродного гена понимают пересадку in vitro рекомбинацией конструкции гена в клетки другого животного вне зависимости от его видовой принадлежности. Если рекомбинантная конструкция гена интегрировалась в геном другого животного, то такой ген обозначается как трансген.

Кодируемый трансгеном белок носит название трансгенного продукта. Животное, которое содержит в своем геноме трансген, называется трансгенным. Если животные передают трансгены своим потомкам, то образуются родственные группы трансгенных животных – трансгенные линии.
Для переноса генов млекопитающих используют три метода:

микроиньекцию рекомбинантной ДНК в пронуклеос зиготы;

использование ретро вирусов в качестве векторов;

инъекцию трансформированных эмбриональных стволовых клеток в эмбрион.

Все методы переноса генетической информации млекопитающих охватывают ранние этапы онтогенеза-от оплодотворенной яйциклетки до формирования бластоцисты, способной имплантироваться в матку реципиента.

Перенос генов методом микроиньекции ДНК в пронуклеус зиготы.

Суть метода заключается в следующем. Из яйцевода самки извлекают зиготы, освобождают их от окружающих фолликулярных клеток, инкубируют в средах Дюльбекко или Виттена под объективом микроскопа. Зиготу фиксируют микропипеткой.С противоположной стороны подводят инъекционную микропипетку, в которой находится раствор с геном.

Для инъекции чужеродной ДНК в мужской пронуклеус зиготы используют плазмиды с конструкциями, промотор и структурный ген.В мужской пронуклеус инъецируют около 1 пл буферного раствора с рекомбинантной ДНК, содержащей до 100 и более копий гена.
Как правило, 60-80% реконструированных зигот хорошо переносят микроманипуляции. После оценки жизнеспособности зиготы трансплантируют ложнобеременной самке-реципиенту другой генетической линии.

Использование ретровирусов в качестве векторов. При переносе чужеродных генов в оплодотворенные в соматические клетки животных в качестве векторов используют ретровирусы, способные внедрятся в геном эмбрионов. Ретровирусы относятся к семейству РНК-содержащих вирусов. Содержат молекулы одноцепочной линейной РНК и обратную транскриптазу (ревертазу)- фермент, с помощью которого в клетке происходит специфический синтез ДНК на РНК. В этом случае генетическая информация передается в обратном направлении от РНК к ДНК. Обратная транскриптаза в ретровирусах способна синтезировать по матрице РНК комплиментарную в ней цепь ДНК, которая служит матрицей другой комплиментарной ДНК-цепи. Вследствие этого создается двуспиральная молекула ДНК, содержащая генетическую информацию вирусной РНК. Такая ДНК интегрируется в хромосомную ДНК клетки, образуя провирус. Под провирусом понимается форма существования генома вируса, при которой этот геном объединен с генетическим материалом клетки-хозяина в единые молекулы ДНК.

После интеграции репликация провируса проходит совместно с ДНК клетки хозяина, вследствие чего провирус передается дочерним клеткам.Для синтеза вирусоспецифических ферментов необходимо присутствие вируса-помощника, у которого после микрохирургии отделяют фрагмент инкапсидации. В результате развивается инфекционный процесс, который заканчивается формированием ретровирусного вектора.

Инъекция трансформированных эмбриональных стволовых клеток в эмбрион. Клеточные популяции, из которых образуются ткани-это клоны, возникши из эмбриональных стволовых клеток или клеток – родоначальниц. Стволовые клетки способны делиться и дифференцироваться в одном или нескольких направлениях. Эмбриональные стволовые клетки получают из бластоцисты мыши. Такие клетки можно размножать, культивировать in vitro, создавать банки клеток с желательными генетическими свойствами. В выделенные клетки можно инъецировать генные конструкции.
Эмбриональные стволовые клетки следует отличать от эмбриональных тератокарциномных стволовых клеток, которые можно выделить из опухоли и культивировать in vitro.
При трансплантации млекопитающих тератокарциномных клеток под кожу у животных возникают тератокарциномы. Если инъецировать тератокарциномные клетки в бластоцисту или агрегировать их с бластомерами нормального эмбриона, можно получить химерных эмбрионов. Развитие их приведет к рождению жизнеспособных химерных мышей, в органах и тканях которых обнаружатся тератокарциномные клетки. У части животных эмбриональные тератокарциномные клетки образовывали репродуктивные органы, и при скрещивании таких химер в первом поколении рождались животные, генетически тождественные животным с эмбриотератокарциноми клетками.

Для получения трансгенных животных необходима генетическая трансформация выделенных ES-клеток, прежде чем последует их включение в реципиентную бластоцисту.
Для проведения генетической трансформации ES-клеток используют два физических метода-электропорацию и микроинъекцию. Суть электропорации состоит в переносе ДНК непосредственно через клеточную мембрану с помощью высоковольтных электрических импульсов. Методом микроиньекции вводят чужеродный ген в ядра ES-клеток.

Метод использования эмбриональных стволовых клеток, который на мышах признан классическим, создает неограниченные возможности в разведении сельскохозяйственных животных как в отношении трансплантации ES-клеток в бластоцисту, так и путем создания и селекции генотипов трансформированных клеточных линий в условиях культивирования in vitro.
Получение трансгенных сельскохозяйственных животных и перспективы их использования.
Успешные эксперименты по получению трансгенных мышей с новыми генетическими признаками способствовали проведению подобных работ и с другими видами млекопитающих -кроликами, овцами, свиньями, крупным рогатым скотом.

Технология получения трансгенных сельскохозяйственных животных имеет свои особенности. Это связано с тем, что у крупных сельскохозяйственных животных зиготы содержат значительные количества жировых и пигментных включений, что существенно затрудняет визуализацию пронуклеусов. Для лучшей визуализации требуются дополнительные микроманипуляции-цетрифугирование, флуоресцентная микроскопия, что снижает жизнеспособность зигот и выход полноценных потомков.

При введении сельскохозяйственным животным генов пептидов и белков можно получить их в больших масштабах. Такие гены в отличие получили название Gene farming. Теоретически возможно промотор коровьего или овечьего белка соединить со структурной частью желаемого гена, например гена инсулина, интерферона, фактора свертываемости и гормонов. Такие гены, как показали эксперименты, как показали эксперименты, экспрессируются в молочной железе и выделяются с молоком.

Трансгенных сельскохозяйственных животных используют для продуцирования человеческого инсулина. Экспериментально было доказано, что ген инсулина человека, введенный геном мыши, функционирует в мышиных клетках поджелудочной железы. Другими словами, ген инсулина человека проявляет себя в организме мыши, как его собственный.

Другой проект связан с получение фактора свертываемости крови человека из молока трансгенных овец и коров. В частности, фактор свертываемости крови человека применяется в фармакологии для лечения гемофилии. Факторы свертываемости крови – дорогостоящие медицинские препараты, поэтому использование трансгенных животных в качестве «биореактора» для производства такого чистого медицинского препарата представляет большой интерес.
Получение трансгенных животных с высокой плодовитостью. Плодовитость относится к полигенным признакам. На ее формирование влияют два гонадотропных гормона ФСГ и ЛГ, которые находятся под генетическим контролем.

В овцеводстве представляют изучения, выделение, клонирование и введение в геном гена многоплодия. В настоящее время проводится изучение структуры этого гена.
Резистентные трансгенные животные. В ряде стран разрабатывается проект создания трансгенных животных, резистентных к ряду заболеваний.

Однако известны немногие гены, контролирующие специфическую резистентность к возбудителям болезни.

В селекции КРС планируются работы по введению генов резистентности к наследственным болезням, болезням конечностей, маститу и др.

Получение трансгенных животных с улучшенными полезно хозяйственными признаками. Улучшить качество продуктов животноводства можно путем создания трансгенных животных, в геноме которых содержится желаемый ген. Проводятся исследования по объединению регуляторной области гена белка и информационного района гена хозяйственно полезного признака. Предложена модель снижения содержания лактозы в молоке коров и овец. Нарушение синтеза лактозы приводит к наследственной болезни - галактоземии с острыми хроническими проявлениями. Предполагается, что получение трансгенных коров и овец, несущих в геноме тканеспецифический промотор и сцепленный с ним ген лактозы на глюкозу и галактозу продуцировать молоко с высокими лечебными свойствами.

В Австралии - разрабатывают проект пересадки новых генов, кодирующих два фермента. Эти ферменты ответственны за синтез аминокислот - цистина и метионина, необходимых для роста шерсти. Недостаток указанных кислот в организме овцы лимитирует рост шерсти.

Трансгенных животных получают и для целей ксенотрансплантации. Одним из излюбленных доноров органов являются свиньи, так как имеется анатомическое сходство органов и сходство иммунологических свойств. Реакции отторжения при трансплантации имеют сложный механизм. Одним из сигналов для атаки организма на чужой орган являются белки, локализованные на внешней поверхности мембраны. У трансгенных свиней эти белки заменены на человеческие.

Еще одно направление трансгеноза – получение устойчивых к болезням животных. Животноводство держится на вакцинах, так как селекция ведется преимущественно на хозяйственно ценные признаки – шерстистость, молочность и т. д. Повышение устойчивости – дело генных инженеров. К защитным белкам относятся интерфероны, поэтому ген интерферона встраивали различным животным. Трансгенные мыши получили устойчивость, они не болели или болели мало, а вот у свиней такого эффекта не обнаружено.

Другое направление – введение генов, кодирующих антисмысловую РНК. Для животноводства острой проблемой являются лейкозы, вызываемые РНК-вирусами. Трансгенные кролики, несущие гены, отвечающие за присутствие в клетке антисмысловой РНК, были устойчивы к лейкозам.

Трансгенных животных можно использовать для изучения наследственных заболеваний мозга и нервной системы. Гены болезни Альцгеймера (отложение белка β-амилоида приводит к образованию характерных бляшек) и гены, отвечающие за развитие эпилепсии, болезней мозга вводятся в геном нормальных животных; при этом получают трансгенных животных-моделей, на которых можно испытывать различные терапевтические приемы.

Трансгенных животных стали использовать для исследования воспалительных и иммунологических заболеваний человека, например, ревматоидного артрита. Моделируются болезни, связанные с липидным обменом.

8. Направления клеточной биотехнологии. Техника культивирования изолированных клеток и тканей растений.

Клеточная инженерия. В рамках этого раздела выделяют культивирование растительных клеток и методы культивирования животных клеток, так как подходы к культивированию этих объектов различаются в силу их принципиальных биологических различий. Клеточная биотехнология обеспечила ускоренное получение новых важных форм и линий растений и животных, используемых в селекции на устойчивость, продуктивность и качество; размножение ценных генотипов, получение ценных биологических препаратов пищевого, кормового и медицинского назначения

В современной биотехнологии выделяют такие направления, микробиологическое производство, клеточная инженерия, генная инженерия.

Использование микроорганизмов для получения ряда веществ (белков, аминокислот и др.) называют микробиологическим синтезом. Для этого создаются микроорганизмы с новыми свойствами. Микробиологическая промышленность выпускает свыше 150 видов продукции. Удалось вывести микроорганизмы, которые синтезируют аминокислоту лизин, не образующуюся в организме человека и некоторых животных. Недостаток лизина в организме задерживает рост животных. Лизин используют как кормовую добавку к рациону сельскохозяйственных животных.

Для получения кормового белка выращивают дрожжи. Использование на корм скоту 1 т. кормового белка экономит 5-8 т. зерна. Добавка 1 т. биомассы дрожжей в рацион птиц способствует получению дополнительно 1,5-2 т. мяса или 25-35 тыс. яиц.

С помощью микроорганизмов получают витамины, органические кислоты - уксусную, лимонную, молочную, а также антибиотики, ферменты, гормоны Для получения всех перечисленных веществ человек создает штаммы микроорганизмов, которые вырабатывают необходимые вещества в количествах, в десятки, сотни и тысячи раз превышающих потребности самих микроорганизмов.

Для извлечения металлов из сточных вод широко используют бактерии, способные накапливать в клетках уран, медь, кобальт. Таким образом, биотехнология участвует в решении экологических проблем.

Микроорганизмы применяют и при решении энергетической проблемы. Для обогрева помещений и приготовления пищи используют биогаз - смесь метана и углекислого газа. Для этого в специальные контейнеры помещают навоз, отходы производства сахара и переработки других продуктов сельского хозяйства, добавляют специальную культуру бактерий, которые питаются изготовленной смесью и выделяют биогаз. Биогаз собирают в специальные емкости. Биогаз давно производят в Индии, Китае, на Филиппинах.

Рулеточная инженерия - это выращивание клеток и тканей высших организмов - растений и животных на специальных питательных средах. Ученые могут получать и выращивать безъядерные клетки, пересаживать ядро из одной клетки в другую. Так удалось 1000 получить гибридные клетки мыши и человека, кошки и собаки.

Хотя клетки животных можно культивировать неограниченно долго, из них не удается вырастить взрослый организм. Из клеток же растений, помещенных на питательную среду, можно вырастить целое растение. Таким путем из небольшой части растения можно получить до 1 млн. растений в год. Этот метод используют для быстрого размножения редких или вновь созданных ценных сортов сельскохозяйственных растений.