Молочнокислые бактерии

Введение.

Молочнокислые бактерии широко распространены в природе. Вопрос о естественной природе их обитания обсуждается в различных работах, авторы которых придерживаются двух точек зрения :одни считают, что это молоко  и молочные продукты, другие склонны назвать поверхность растений, ризосферу и прикорневую зону. В месте с растениями молочнокислые бактерии попадают в желудочно-кишечный тракт человека и животных, составляя его микрофлору. Элективной средой является молоко и молочные продукты. Бактерии рода Bifidobacterium преобладают в кишечнике грудных детей, особенно вскармливаемых грудью, поскольку эти бактерии нуждаются в углеводах, содержащих X-ацетилглюкозамин, который найден только в женском молоке. Обнаружены они и в кишечной флоре взрослых людей, а также в гниющем иле.

Основным свойством молочнокислых бактерий, по которому  их объединяют в отдельную обширную группу микроорганизмов, является способность образовывать в качестве главного продукта брожения молочную кислоту. Молочнокислое брожение осуществляют бактериальные организмы, гетерогенные по морфологии, относящиеся к родам Lactobacillus, Leoconostoc, Bifidobacterium, Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus. Следует отметить, что по морфологии молочнокислые кокки – типичные стрептококки серологической группы N, кроме Streptococcus thermophiles, относящийся к группе D. Однако недавно по систематическому положению они выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего и патогенные формы, и под новым названием Lactococcus отнесены к категории «GRAS», куда относятся микроорганизмы, не вызывающие инфекционных заболеваний человека и животных. В этот раздел отнесены следующие виды и подвиды: L. lactis – подвиды cremoris, hordniae, lactis; L. Garvieae; L. Pischlum; L. Plantarum; L. Raffinolactus.

Молочнокислые бактерии по характеру продуктов  сбраживания гексоз (глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза), дисахаридов (лактоза, мальтоза, сахароза) и полисахаридов (декстрин,крахмал), согласно терминологии, предложенной А.И. Клюйвером и Г. Л. Донкером в 1925 г., относят к гомоферментативным и гетероферментативным.

Гомоферментативные молочнокислые бактерии

Гомоферментативное молочнокислое брожение представляет собой эволюционно самый древний и примитивный метаболический путь. Последовательность  биохимических реакций, лежащих  в основе этого брожения, осуществляется по гликолитической схеме Эмбдена – Мейергофа – Парнаса – по именам исследователей, внесших большой вклад в изучении этого процесса. Основной энергетический субстрат для молочнокислых бактерий, осуществляющих гомоферментативное  молочнокислое брожение, - моносахара (в первую очередь, глюкоза) и дисахара (лактоза, мальтоза). Распад отдельных, существенных для бактерий углеводов завершается, как правило, образованием трех главных моносахаридов – глюкозы, фруктозы и галактозы, которые служат исходным материалом для осуществления различных реакций обмена веществ.

Гомоферментативное молочнокислое брожение интересно тем, что в нем процесс сбраживания углевода наименее связан с конструктивным обменом, в результате чего 98 % углевода превращается в молочную кислоту. Это объясняется тем, что углевод или совсем не расходуется, или используется в незначительном количестве, так как конструктивный обмен, за счет которого бразуется масса бактерий, основан на использовании аминокислот среды. Молекулярный кислород не влияет на процесс молочнокислого брожения, и клетки способны расти в его присутствии. Гомоферментативные молочнокислые бактерии являются факультативными анаэробами. В их клетках найдены флавиновые ферменты, с помощью которых кислород постепенно восстанавливается до перекиси водорода. Накопление перекиси замедляет окисление глюкозы, ингибирует рост.

Лишь небольшая  часть пирувата подвергается декарбоксилированию с превращением в уксусную кислоту, этиловый спирт, углекислоту и следы ацетоина. В процессе гомоферментативного молочнокислого брожения большая часть пирувата восстанавливается до лактата лактатдегидрогеназой. Оптическая активность образуемого лактата различна у разных бактерий и зависит от стереоспецифичности этого фермента, а также от того, содержит ли клетка лактатрацемазу, превращающую D- лактат в L – форму.

Гомоферментативные молочнокислые бактерии включают морфологически разные группы – кокки (роды Lactococcus, Streptococcus,  Pediococcus) и палочковидные формы (род Lactobacillus). Молярное содержание ГЦ в ДНК в кокках находятся в пределах 33 – 44 %, а в лактобациллах – 35- 51% . При сбраживании глюкозы или глюконата образуют D-,L- или DL- молочную кислоту без образования газа, не сбраживают рибозу и не нуждаются в тиамине. Представители гомоферментативных молочнокислых кокков рода Lactococcus образуют в основном молочную кислоту в конфигурации D-, а рода Pediococcus – в конфигурации DL-. Гомоферментативные молочнокислые бактерии рода Lactobacillus образуют разные формы молочной кислоты: D молочную  кислоту – Lb. Delbruekii, Lb. leichemani, Lb. jensenii, Lb. lactus, Lb. bulgaricus; DL – молочную кислоту – Lb. Helveticus, Lb. acidophlus. Бактерии Lb. salivarus образуют главным образом L- молочную кислоту, но есть и следы D – молочной кислоты. Лактобациллы Lb. casei subsp.casei, Lb casei subsp. Tolerans, Lb. casei subsp rhamnosus, Lb. lactosus, Lb. xylosus образуют L- молочную кислоту, однако другие виды ( Lb. casei subsp. Pseudoplantarum, Lb. curvatus) образуют DL – молочную кислоту и сбраживают рибозу.

Гетероферментативные молочнокислые бактерии.

Гетероферментативные молочнокислые бактерии образуют лактат иным путем. Процесс гетероферментативного молочнокислого брожения более сложный чем, гомоферментативного типа. Последняя стадия, восстановление пирувата, такая же, как и при гомоферментативном молочнокислом брожении, но пируват образуется при расщеплении глюкозы исключительно по гексозомонофосфатному пути, а из ксилулозо – 5 – фосфата образуются 3 – фосфоглицериновый альдегид и ацетилфосфат. Затем 3 – фосфоглицериновый альдегид превращается в пировиноградную кислоту, а уже из нее образуется как молочная кислота, так и этанол. Ацетилфосфат отдает фосфат на АДФ, превращаясь в уксусную кислоту.

В процессе брожения из одной молекулы глюкозы  образуется 1 молекула АТФ. Итак, в процессе гетероферментативного молочнокислого брожения кроме лактата образуются значительные количества уксусной кислоты, этилового спирта, углекислого газа и иных побочных нейтральных проуктов   ( диацетила, ацетонина), на это используются о 50 % сбраживаемых гексоз. Известен другой тип гетероферментативного молочнокислого брожения, когда бактерии вместо этаола образуют другие спирты, например маннит (Leuconostoc mesenteroides) или глицерин.

Представителями гетероферментативных молочнокислых бактерий являются некоторые палочковидные лактобациллы из родов Lactobacillus и Streptobacterium,вариабельные по формебифидобактерии из рода  Bifidobacterium и кокковые - род Leuconostoc.

При изучении молочнокислого брожения в динамике развития культур было установлено, что химические превращения в  среде изменяются по ходу развития. При сбраживаии углеводов ясно можно различить две фазы. В первый период ( логарифмическая фаза роста бактерий ) идет интенсивный синтез белков и других веществ клетки, более восстаовленных, чем углеводы. В среде накапливаются более окисленные продукты обмена. Вторая фаза характеризуется замедлением биосинтеза и постепенным снижением окислительно – восстановительного потенциала в культуре.

Морфология  клеток молочнокислых бактерий

Для микроскопических исследований морфологии молочнокислых бактерий, выросших на молоке или молочных продуктах, готовят  фиксированные окрашенные препараты. Для этого бактериологическую петлю  вводят в молочный сгусток и размазывают  его по поверхности предметного стекла тонким слоем. Препарат сушат на воздухе, затем фиксируют смесью спирта с эфиром в соотношении 1:1, несколько раз нанося смесь на мазок. Обработка препарата эфиром приводит к извлечению и удалению жира из мазка. Фиксированный препарат  рекомендуют окрашивать мителеновым синим в течении 2 – 3 минут, поскольку именно этот краситель слабо окрашивает основной фон препарата ( казеин молока ) и хорошо прокрашивает клетки, что обеспечивает четкость препарата.

Молочнокислые бактерии неподвижны, не образуют спор, капсул, положительно окрашиваются по Грамму. По форме клеток молочнокислые  бактерии представляют собой кокки  сферической или эллипсовидной  формы и палочки разной длины  и формы. Форма и длина клеток у различных культур одних  и тех же видов молочнокислых  бактерий часто зависит от состава  среды, присутсвия кислорода и способа культивирования. Бактерии рода Lactococcus – круглые или слегка овальные клетки, расположенные единично, парами или цепочками. Типичный представитель этого рода L.lactis subsp. Lactis некоторые считают палочковидной формой, поскольку его клетки больше в длину, чем в ширину, а в сброженном молочном сгустке преобладают сочетания в виде диплококков. Сливочный лактококк L. lactis subsp. Cremoris отличается от предыдущего тем, что его клетки располагаются в виде длинных цепочек. Большинство штаммов термофильных стрептококков Streptococcus thermophiles также образуют длинные цепочки.

Род Lactobacillus по морфологии характеризуются большим разнообразием – от коротких коккообразных до нитевидных палочек длиной от 0,7 – 1,1 до 3,0 – 8,0 мкм,расположенных единично или собранных в цепочки. Значительное увелечение длины клеток лактобацилл наблюдается при недостатке витамина В12, культивировании в средах с высоким содержанием этилового спирта, антибиотиков, при воздействии на клетки лизоцима и ионизирующего излучения. Группа молочнокислых палочек по своим свойствам разделяется на термофильные, мезофильные и газообразующие. Мезофильные палочки из подрода Streptobactreium мельче и тоньше термофильных, а газообразующие  бетабактерии (Betabacterium)по морфологии сходны с мезофильными стрептобактериями.

Молочнокислые бактерии размножаются делением перегородкой. Если клетки делятся в одной плоскости, это приводит к образованию цепочек; когда же деление идет в двух плоскостях, образуются так называемые тетрады, характерные для молочнокислых бактерий рода Pedicoccus. Клетки бактерий рода Leoconostoc сферические, часто чечевицеобразные, делятся в двух плоскостях, образуя пары или тетрады. Клетки рода Lactococcus делятся в одной плоскости, в результате чего образуются пары и цепочки кокков. Бактерии Bifidobacterium bifidum представляют собой палочки, изогнутые, булавовиные и разветвленные, расположенные поодиночке, парами или цепочками, V- образно, палисадом или розеткой, иногда встречаются раздутые кокковидные формы.

На агаровых средах бактерии формируют колонии  сферические, часто чечевицеобразные, выпуклые белые или слегка кремового цвета. Форму колоний исследуют в глубине агара после засева его уколом или внесения в него небольшой петлей культуры, выросшей в жидкой среде. Термофильные  молочнокислые палочки образуют шероховатые колонии, мезофильные, как правило, гладкие, округлой формы. Lb. bulgaricus на плотных средах образует мелкие характерные колонии в виде комочков ваты.

Молочнокислые бактерии под влиянием факторов внешней  среды часто подвержены диссоциации  популяции на R-,S- и М- варианты, отличающиеся  по генетическим, морфологическим и физиолого – биохимическим признакам.

Ультраструктура клеток молочнокислых бактерий и  ряда других граммположительных бактерий во многом похожа. Внутренняя структура клеток может быть различной у отдельных видов. Иногда палочковидные формы содержат зерна метахроматина, который может образовывать  в них крупные включения. Нахождение таких включений в таких клетках характерно для определенных видов рода Thermobacterium. Например, Lactobacillus helveticus и Lb. jugurti можно отличить от Lb. Bulgaricus и  L. lactis по присутсвию у последних метахроматиновых гранул, которые обнаруживаются при выращивании бактерий в молоке с глюкозой и дрожжевым автолизатом.

Физиолого – биохимические свойства молочнокислых бактерий

Простота  внешней формы молочнокислых  бактерий  и строения их клетки делают чисто морфологическую классификацию  молочнокислых бактерий затруднительной. Поэтому культуральные и физико – биохимические признаки, наряду с морфологическими, занимают важное место. Из культурных  признаков используют характер роста на МПБ (пленка, муть, осадок), тип колоний на МПА, рост в присутствии 4 % NaCl (осмотолерантность).  По отношению к молекулярному кислороду бактерии являются факультативными анаэробами, но Bifidobacterium bifidum – строгие анаэробы. Молочнокислые бактерии каталазо- и оксидазо – отрицательные, не образуют пигмент, кроме Leuconostoc citreum, образующего капсулы и желтый пигмент, не восстанавливают нитраты в нитриты. Однако описаны штаммы, по некоторым свойствам отличные от типичных. Они подвижны, восстанавливают нитраты в нитриты, образуют споры, дают положительную реакцию на каталазу

Некоторые молочнокислые  бактерии способны разлагать образующуюся при использовании определенных субстратов перекись водорода благодаря  наличию у них каталазной активности, осуществляемой так называемой псевдокаталазой. Псевдокаталаза обнаружена у штаммов Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum при выращивании их на питательном агаре с 0,5 % глюкозы. Второй фермент, разрушающий перекись, каталаза, найден у ряда молочнокислых бактерий только при выращивании их на среде, содержащей прогретую кровь или гематин.

 Физиологической  особенностью молочнокислых бактерий  является их кислоустойчивость, как следствие характерного для них энергетического обмена. Кокковые формы могут развиваться в нейтральных и щелочных средах, большинство же палочковидных форм не способны расти в среде с pH выше 6,0; бифидобактерии не растут при pH выше 8,2. Рост всех молочнокислых бактерий продолжается до тех пор, пока в процессе брожения углеводов pH в среде не снизится до 5,0 и ниже. В результате жизнедеятельности гомоферментативных  лактококков накапливается до 1 %, а Lb. bulgaricus – до 3,5 % молочной кислоты.

Молочнокислые бактерии обладают определенной протеолитической активностью, обуславливаемой действием  внеклеточных и внутриклеточных протеиназ и пептидаз. Протеолитическую активность проявляют как кокковые формы, так и лактобактерии, включая термофилов. Молочнокислые палочковидные обладают  большей протеолитической активностью, чем кокковые формы. Например, L. lactis subsp. Casei могут  переводить до 25 – 30% казеина в растворимую форму, тогда как L. Lactis subsp cremoris и L.  Subsp lactis – 15 – 17 % . Гидролиз молочнокислыми бактериями большинства пептидов (например, DL – аланилглицина и глицил – DL – аланина) сильно стимулируется ионами кобальта при pH 5,5 – 6,0.