Молочнокислые бактерии

Молочнокислые бактерии либо вовсе не обладают  липолитической активностью, либо проявляют ее  в определенной степени при воздействии на некоторые субстраты. Штаммы многих видов лактококков ( L. lactis, L. cremoris, L. diacetilactis, Streptococcus thermophiles,а также Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus cerevisiae) и лактобацилл (Lb. Helveticus, Lb. delbrueckii, Lb. casei, Lb. pentosus и Lb. brevis) в качестве субстрата используют некоторые триглицериды.

Следует отметить, что молочнокислые бактерии явились  объектом, с пмощью которого были открыты некоторые новые жирные кислоты. Иззучая природу жирных кислот у отдельных лактобацилл, установили, что «свободные» и «связаные»  липиды, извлеченные из Lb. Arabinosus, содержат пальмитиловую, стеариновую, а также ранее неизвестную жирную кислоту – лактобацилловую (C19H36O2).

Отдельные виды лактобацилл (Lb. fermenti, Lb. Casei, Lb. salivarius, Lb. viridescens) способны образовывать внеклеточные нуклеазы при выращивании на агаре, содержащем ДНК или РНК. Судя по величине диаметра светлых зон вокруг колоний на агаре с ДНК (зоны до 3 – 4 мм) некоторые штаммы Lb. Fermenti характеризуется значительной ДНКазной активностью. Иногда лактобациллы синтезируют одновременно и внеклеточные ДНКазы и РНКазы.

Если способность  к образованию ацетоина достаточно распространена у молочнокислых бактерий, то штаммы, образующие диацетил в значительных количествах, встречаются достаточно редко. Все известные штаммы, синтезирующие диацетил, образуют и ацетоин, однако, если штамм образует ацетоин, это еще не значит, что при этом синтезируется и диацетил.

В основном молочнокислые бактерии культивируют на средах с шестиуглеродными сахарами, но они могут также сбраживать некоторые пятиуглеродные сахара, сахароспирты, органические кислоты и полисахариды.

Отличительным признаком молочнокислых бактерий является высокая потребность в  сложных питательных веществах, определенных аминокислотах, витаминах, особенно группы В. Наиболее важным источником энергии для молочнокислых бактерий являются моно- и дисахариды – глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, но одновременно они не сбраживают трисахарид рафинозу и пентозу ксилозу. Используют в качестве источника энергии и в конструктивном обмене также органические кислоты, такие, как лимонную, яблочную, пировиноградную, фумаровую и др. Свойство сбраживать различные сахара и органические кислоты, в частности рибозу, цитрат или ацетат, лежит в основе отличительных тестов для идентификации молочнокислых бактерий.

Определение количества молочной кислоты

Количество  молочной кислоты определяют методом  титрования и по разности между объемом 0,1 н. раствора NaOH, пошедшего на титровпние среды культивирования до и после роста бактерий. Для титрования берут 10 мл культуральной жидкости или обрата, помещают в колбу Эрленмейера, добавляют 20 мл дистилированной воды, 1 – 2 капли фенолфталеина и титруют 0,1 н. раствором NaOH при постоянном взбалтывании до появления устойчивой слабо - розовой окраски. Кислотность молока или культуральной  жидкости выражают в градусах Тернера ( Т ) или процентах молочной кислоты.Так 1 Т соответствует 1 мл 0,1 н. раствора NaOH пошедшего на титрование 100 мл исследуемой среды. Общее содержание молочной кислоты выражается в процентах. Поскольку известно, что молекулярная масса молочной кислоты составляет 90, то для приготовления 1 л 1 н. раствора требуется 90 г кислоты, значит, в 1 мл 0,1 н. раствора содержится 0,009 г кислоты, что соответствует 1 Т.

Качественная реакция на молочную кислоту

Принцип реакции состоит в переводе молочной кислоты в уксусный альдегид в кислой среде при температуре кипения в присутствии перманганата KMnO4 и взаимодействия альдегида с аммиачным серебром, дающего реакцию «серебряного зеркала». Для проведения реакции культуральную жидкость или сброженный обрат фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Берут 5 мл фильтрата, помещают в колбу Эрленмейера, добавляют 2 мл крепкой серной кислоты и, взбалтывая, нагревают на асбестовой сетке до начала кипения. Затем, продолжая помешивание, по каплям пипеткой добавляют 5 мл 5%-го раствора KMnO4, который в процессе реакции обесцвечивается. При этом молочная кислота переходит в уксусный альдегид. Для проведения характерной реакции быстро покрывают горлышко колбы фильтровальной бумагой, смоченной аммиачным раствором нитрата серебра. Фильтровальную бумагу аккуратно прижимают к краям колбы, продолжая нагревание. Уксусный альдегид улетучивается и, вступая в реакцию с аммиачным раствором AgNO3, вызывает почернение бумаги серебристыми разводами (выделяется металлическое серебро).

Аммиачный раствор нитрата серебра AgNO3 готовят следующим образом: к 1 – 2 мл 10%-го раствора AgNO3 в пробирке приливают по каплям аммиак, что приводит к выпадению осадка Ag2O, постепенно растворяющегося далее в избытке аммиака.

Выделение и идентификация молочнокислых  бактерий

Молочнокислые бактерии, обитающие в природных  и производственных субстратах, обычно не занимают доминирующего положения, над ними превалируют различные  сапрофитные микроорганизмы, такие, как грамотрицательные  бактерии, споровые и бесспоровые формы, кокки, дрожжи, плесени. Поэтому для их выделения используют элективные питательные среды, способствующие их росту и угнетающие рост сопутствующей микрофлоры. В качестве ингибиторов роста посторонней микрофлоры  в среды добавляют сорбиновую и уксусные кислоты, спирт, азид натрия и др.

Источниками для выделения лактококков служат кисломолочные продукты (сметана, простокваша, сыры, кефир и др.), лактобацилл – силос и травы, пищевые продукты и фекалии. Для определения присутствия и учета молочнокислых бактерий навеску испытуемого материала разводят в физиологическом растворе и высеивают в жидкие накопительные среды или же сразу на твердые агаровые среды для подсчета их количества.

Известна  высокая питательная ценность сред из гидролизата молока, пригодных для учета и выделения молочнокислых бактерий. Для приготовления гидролизата берут 1 литр пастеризованного при 85 С и охлажденного до 45 С обезжиренного молока, доводят активную кислотность 40-% водным раствором NaOH до pH 7,4 – 7,6, добавляют к нему 1 грамм порошка панкреатина и 5 мл хлороформа и помещают в термостат на 40 С  на 72 часа. Затем гидролизат фильтруют, устанавливают pH, равным 7,0 – 7,2 и стерелизуют при 1 атм в течение 10 минут. Для приготовления агаризованных сред гидролизат разводят 2 раза водопроводной водой, добавляют 2,5% дрожжевого автолизата и 2,0 агар – агара. Учет количества бактерий облегчается при добавлении в среду инкубирования 2 мл 0,1% -го  раствора индикатора бромкрезолового пурпурного или мела (100 мл 3%-й суспензии углекислого кальция на 1 л ), образующих при глубинном инкубировании прозрачную зону  просветления вокруг колоний.

Для выделения  ароматобразующих лактоккоков L.  Lactis subsp diacetilactis из исследуемых образцов в гидролизат молока добавляют 1% лимоннокислого натрия. После культивирования бактерий в этой накопительной среде в течение 18 – 24 часов при 30 С суспензию высеивают глубинным посевом на агаризованную среду того же состава. По пузырькам газа, выделяющегося при использовании цитрата, находят колонии этих лактококков. Для выделения слизеобразующих бактерий Leuconostoc mesenteroides в эту же среду добавляют 1% сахарозы.

При разделении смешанных культур лактоккоков рекомендуют среду Редди с аргинином следующего состава (%); триптон – 0,5; CaCO3 – 0,3; КМЦ – 0,6 (карбоксиметилцеллюлоза для суспендирования CaCO3); k2HPO4 – 0,1; дрожжевой экстракт – 0,5; L – аргинин солянокислый – 0,5; агар – 1,5; pH после стерилизации при 1 атм в течение 15 минут должен быть 6,3. Кроме расплавленной и остуженной до 45 – 50 С основы добавляют 5 мл обезжиренного стерильного молока и бромкрезоловый пурпурный или мел в количествах, как указано выше. На этой среде L. lactis subsp cremortis, не гидролизующий аргинин, образует желтые колонии, а L. Subsp lactis и L. Subsp. Diacetilactis – белые.

В состав сред для выращивания лактобацилл входят ингридиенты, богатые аминокислотами, витаминами. Добавляют томатный сок, дрожжевой экстракт или автолизат как источник пуринов и пиримидинов, необходимых для роста. Среда РС для выделения бактерий рода Lactobacillus и Lactococcus plantarum содержит (%): пентон – 1,0; глюкозу – 2,0; печеночный экстракт – 1,0; дрожжевой экстракт – 0,2; полисорбат – 0,8; K2HPO4 – 0,2; MgSO4 – 0,2; MnSO4 – 0,05; триаммониевый цитрат – 0,2; ацетат натрия – 0,5: твин – 80 – 0,01. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. Устанавливают pH 6,2. Для повышения селективности в среду перед засевом добавляют 1 мл 0,4% -го щелочного раствора сорбиновой кислоты. Испытуемый материал засевают вначале в жидкую среду, а затем наливают на  нее «голодный агар» (столбик высотой до 2 см) для создания анаэробных условий, инкубируют в течение 5 сут при 30 С или 3 сут при 37 С. При наличии мути и газообразования инокулят высевают на агаризованную среду того же состава, инкубируют при заданной температуре и производят подсчет лактобацилл через 48 часов. Для создания анаэробных условий на застывшую в чашках Петри среду с инокулятом наливают второй слой расплавленной и остуженной голодной агаровой среды в количестве 5 см3.

Для выделения  бактерий рода Bifidobacterium используют кукурузно – лактозную среду. Для приготовления среды берут 25 г агара  из расчета на 1 л, расплавляют его в небольшом количестве воды, а к остальному количеству дистиллированной воды добавляют 10 г пептона; 40 мл водного раствора кукурузного экстракта, разбавленного в соотношении 1:1; 6,6 г натрия лимоннокислого трехзамещенного; 0,12 г MgSO4; 2 г K2HPO4. Смесь нагревают до 80 С и соединяют с расплавленным агаром, затем добавляют 10 г лактозы, 0,15 г цистеина солянокислого и 0,5 г аскорбиновой кислоты. Предварительно цистеин разбавляют в небольшом количестве дистиллированной воды и устанавливают pH 8,45 раствором гидроокиси натрия. Всю смесь доводят до 1 л водой и устанавливают pH среды 7,0. Среду разливают в пробирки высоким столбиком по 10 мл и стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 минут.

Исследуемый образец разводят в физиологическом  растворе, нейтрализуют  10% -м раствором  гидрокарбоната натрия и засевают  из серии разведений в пробирки со средой, предварительно прокипяченной  в течение 15 минут для снижения в ней содержания растворенного кислорода. В момент посева температура среды должна быть 38 С. Пробирки с посевами инкубируют при 37 С в течение 72 часов, но просматривают посевы и через 24 – 48 часов. По окончании учитывают колонии, выросшие в последних разведениях, где выросли типичные колонии для бифидобактерий – в виде «гвоздиков», «вытянутых веретен» иногда  в виде «полос», расположенных вдоль пробирки. На плотных средах колонии имеют вид «дисков» или «гречишных зерен». Выросшие колонии подсчитывают с учетом разведения.

Для культивирования  бактерий рода Bifidobacterium известна так же среда, приготовленная на водопроводной воде, содержащая (г/л) : гидролизат казеина – 10; мясной экстракт – 5,0; дрожжевой экстракт – 5,0; глюкоза – 10,0; K2HPO4 – 3,0; твин – 80 – 1,0 мл, pH 6,8. После стерилизации  при 0,5 атм в среду добавляют 1,0%  аскорбата натрия и 0,05% цистеина солянокислого.

Принадлежность  каждой отобранной колонии к определенным микроорганизмам определяют по отношению  к окраске по Граму, по подвижности и другим морфологическим признакам. Культуры, образующие псевдокаталазу, относят к Pediococcus, как микроорганизмы, не имеющие цитохромов, но дающие положительную реакцию с бензидином. При идентификации бактерий рода Leuconostoc препарат окрашивают  по Бури для выявления капсул. Отсутствие роста в МПБ при pH 9,6 и с 6,5% -м NaCl характерно для лактококков и Streptococcus thermophiles . Причем, инкубируя последние на питательной среде при 45 С в течение 3 суток, можно отделить мезофильные кокки. После выделения чистую культуру пересеивают в обрат и наблюдают характер во время образования молочного сгустка. Лактококки L. lactis subsp. lactis образуют плотный сгусток за 6 – 10 часов с максимальной кислотностью  100 – 125 Т; L. Lactis subsp. Cremoris дает сметанообразный сгусток за это же время; L.lactis subsp. Diacetilactis свертывает молоко за 18 – 48 часов. Активные расы термофильных лактобацилл при оптимальной температуре сбраживают молоко за 10 – 12 часов, причем предельная кислотность достигает 300 – 450 Т, мезофильные стрептобактерии образуют плотный сгусток через 3 – 5 суток с кислотностью 200 – 250 Т, а газообразующий тип лактобацилл не образует сгустка.

Молочнокислые бактерии синтезируют различные  ингибиторные вещества, например: кислоты, ацетон, перекиси, а также низкомолекулярные  антимикробные белки – бактериоцины, которые подавляют рост сопутствующей микрофлоры.

Образование бактериоцинов молочнокислыми бактериями

Бактериоцины составляют большое семейство полипептидов, которые подразделяют на различные классы, основываясь на их действии и структуре. Все бактериоцины по биохимической природе являются белками. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что что большинство антибактериальных веществ, относящихся к бактериоцинам, разрушаются протеолитическими ферментами, но у разных бактериоцинов чувствительность к протеазам варьирует. Некоторые бактериоцины резисцентны к действию протеаз. Устойчивые к протеазам бактериоцины, например низин и лактицин 481, образуемые L. Lactis subsp. Lactis., характеризуются наличием в их молекулах сульфидных колец, которые содержат мезо – лантионин бето – метиллантонин, а также необычные аминокислоты – дегидромасляную и D- дегидроаланин.

Бактериоцины имеют молекулярный вес от 3 до 10 кДа.  Белок бактериоцинов связан с липосахаридом клеточной оболочки, но именно белковая часть комплекса обладает антибактериальной активностью. Эти факты указывают на наличие в клетках особых механизмов, регулирующих функции бактериоциногенных факторов.. Биосинтез бактериоцинов, наследственная особенность организмов, проявляющаяся в том, что каждый  штамм способен один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ.

К числу  общих свойств бактериоцинов относится их чувствительность к температурным воздействиям, хотя это свойство также варьирует в широких пределах. Одни из них разрушаются уже при температуре 48 – 50 С, другие кратковременно выдерживают температуру 60 – 70 С, а отдельные сохраняют активность даже при 100 С, например, низин выдерживает кипячение до 120 С без потери активности.

Существуют  различные способы выявления  антибиотических свойств микроорганизмов. Многие из них основаны на способности  антибиотических веществ диффундировать в плотные агаризованные среды и образовывать зоны подавления роста тест – организма. Величина зоны отсутствия роста указывает на степень активности данного антибиотического вещества в отношении  исследуемой тест – культуры и зависит от его концентрации и химической природы.

За единицу  активности бактериоцина низина принимают такое его количество, которое подавляет рост Streptococcus agalactiae (стрептококка группы В, присутствующего в желудочно – кишечном тракте) в 1 мл питательного бульона за 16 часов инкубирования, учитывая, что 1 мг чистого низина содержит 40 000 международных единиц ( МЕ ).

Низинообразующую активность определяют микробиологическим методом с помощью тест – культуры Bacillus coagulans – термофильный споровой кислотоустойчивой бактерией, которую выращивают в агаровой среде, приготовленной на бульоне Хоттингера с добавлением ( г/л ): NaCl – 2,0; агар – 20,0; пептон – 10,0; глюкоза – 10,0. Стандартом служат растворы очищенного коммерческого препарата Nisaplin («Appin& Barrett,Ltd.», Великобритания ) с активностью 5, 10, 15, 20, 40 МЕ/мл. Для титрования бактериоцина используют суспензию 17 – ти часовой культуры бациллы с оптической плотностью 0,7, которой засевают среду, приготовленную на фосфатном буфере (pH 5,0) и содержащую  ( г/л):пептон – 20,0; глюкозу – 10,0; агар – 20. Экстракцию антибиотика из культуральной жидкости и стандартных растворов проводят смесью ацетон: уксусная кислота: вода( 4:1:5 ) при 55 С в течение 90 минут. Экстракты разводят  фосфатным буфером (pH 5,0) в соотношении 1:10 и вносят в лунки на агаровой среде с тест – организмом, затем инкубируют при 55 С в течение 17 часов. Количественное определение антибиотической активности проводят по измерению зон подавления роста В. Coagulans с дальнейшим пересчетом по калибровочной кривой стандартных растворов низина.