Микробиология

По сравнению с предыдущими  вспышками, эпидемия птичьего гриппа 2004 года может охватить гораздо большее  число ферм. Одновременно возможна трансмиссия вируса через Азию, так  как не контролируются факторы, вызывающие распространение вируса. ВОЗ отмечает, что почти одновременные вспышки  птичьего гриппа в Японии, Северной Корее, Вьетнаме, а теперь и в Таиланде и Камбодже исторически беспрецедентны и существует опасение, что этот новый, вирулентный штамм вируса птичьего гриппа может поразить весь мир.

Скорость эволюции вируса птичьего гриппа в природных хозяевах (водоплавающие птицы, ржанки и чайки) и аберрантных хозяевах (куры, индейки, поросята, лошади и люди) различается. Скорость эволюции, определенная для  всех трех вспышек, была сходной со скоростью, наблюдаемой у млекопитающих, что служит веским доказательством  адаптации вируса птичьего гриппа к  новым видам хозяев. Пока что, по-видимому, птичий грипп не передается от человека к человеку, однако из-за эпидемии среди  домашней птицы такая передача становится все более вероятной. Необходима всего лишь правильная рекомбинация между штаммом H5N1 и сосуществующим штаммом гриппа человека. Это может  произойти, если кто-либо из людей или  других животных заболеет человеческим и птичьим гриппом одновременно, что позволит вирусам обменяться генами и образовать новый штамм, который сможет легко передаваться от человека к человеку. До сих пор  нет доказательств, что это произошло, поскольку во всех известных случаях болезни инфицирование происходило при прямом контакте с курами. Данная ситуация опасна тем, что если возникнет пандемия, она будет более трагична по последствиям, чем пандемия 1968 года.

Птичий грипп поражает в основном детей - по сообщениями  агентства Рейтер на 26.01.2004г. из 7 жертв  птичьего гриппа 6 - дети. Почему это  происходит, неизвестно.

          Клинические проявления, патогенез

Симптомы птичьего гриппа у человека варьируют от типичных гриппо-подобных симптомов (лихорадка, кашель, боль в горле и боль в  мышцах) до инфекции глаз, пневмонии, острого  респираторного заболевания, вирусной пневмонии и других тяжелых, угрожающих жизни симптомов.

Патогенез вируса птичьего гриппа изучался на мышах, поскольку это  одна из наиболее широко применяемых  и изученных моделей для исследования патогенеза вирусов на млекопитающих, однако в качестве альтернативы предлагается изучать вирус птичьего гриппа на хорьках, для которых он также  является патогенным.

Исследование патогенности птичьих и человеческих изолятов вируса H5N1 из Гонконга на 6-8 недельных  мышах BALB/c показало, что как птичьи, так и человеческие изоляты вызывали у мышей заболевание, характеризующееся  гипотермией, клиническими симптомами, быстрой потерей веса и 75-100% смертностью  на 6-8 день после инфицирования. Три  изолята не из Гонконга не давали никаких  клинических проявлений. Один изолят A/tk/England/91 (H5N1) вызывал заболевание  средней тяжести и все животные, кроме одного, выздоровели. Инфекция приводила к поражению (от легкого  до тяжелого) как верхних, так и  нижних отделов респираторного тракта. Наиболее часто вирус вызывал  некрозы в респираторном эпителии полости носа, трахеи, бронхах и  бронхиолах с сопутствующим воспалением. Наиболее серьезные и обширные поражения  наблюдались в легких мышей, инфицированных гонконгским вирусом птичьего гриппа, в то время как у мышей, инфицированных вирусами A/ck/Scotland/59 (H5N1) и A/ck/Queretaro/95 (H5N2), поражения были слабыми или не наблюдались вовсе. Вирусы A/ck/Italy/97 (H5N2) и A/tk/England/91 (H5N1) проявили промежуточную  патогенность, давая поражения респираторного тракта от слабых до средних. Кроме  того, инфекция, вызванная различными изолятами вируса, могла быть в  дальнейшем определена по иммунному  ответу мышей. Изоляты не гонконгского происхождения после инфицирования  вызывали продуцирование повышенных уровней  активного трансформирующего фактора  роста b, в то время как гонконгские  изоляты такого не вызывали.

При заражении мышей человеческим изолятом вируса гриппа А H5N1, выделяются две группы, отличающиеся по вирулентности. Используя современные методы генетики, было показано, что мутация в позиции 627 в белке РВ2 влияет на исход  инфекции у мышей. Более того, высокая  расщепляемость гемагглютина является необходимым условием летальности  инфекции.

Более ранние исследования также  указывали на наличие двух групп  вирусов: группа 1, для которой MLD50 находилась между 0.3 и 11 PFU, и группа 2, для которой MLD50 была более 103 PFU. Спустя день после  интраназальной инокуляции мышам 100 PFU вируса группы 1, титр вируса в легких составлял 107 PFU/g или на 3 log больше, чем  для вирусов второй группы. Оба  типа вирусов реплицировались до высоких титров (>106 PFU/g) в легких на 3 день и оставались на этом уровне в течение 6 дней. Более важно то, что только вирусы первой группы вызывали системную инфекцию, реплицировались в нереспираторных органах, включая головной мозг. Иммуногистохимический анализ показал, что репликация вирусов первой группы происходила в нейронах головного мозга, глиальных клетках и кардиальных миофибрах.

Механизм вирулентности, ответственный за летальность вирусов  гриппа у птиц, действует также  и у хозяев-млекопитающих. То, что  некоторые вирусы H5N1 не продуцировали  системной инфекции на моделях, свидетельствует  о том, что множественные факторы, которые еще должны быть установлены, вносят свой вклад в тяжесть H5N1 инфекции у млекопитающих. Кроме того, способность  этих вирусов продуцировать системную  инфекцию на мышах и отчетливые отличия  в патогенности среди изолятов, показывает, что эта система является полезной моделью для изучения патогенеза вируса птичьего гриппа на млекопитающих.

Кроме того, показано, что  одним из факторов, оказывающих влияние  на патогенез вируса H5N1, является деструктивное  влияние на иммунную систему, которое  отличается у летальных и нелетальных  изолятов вируса H5N1.

Биохимическим аспектам, которые  влияют на вирулентность, адаптацию  вируса к новому хозяину, иммунный ответ  и патогенез, посвящен целый ряд  работ .

         Вакцины

Сразу же после вспышек 1997-1999 годов начались поиски вакцины против вируса птичьего гриппа. Поскольку  неадаптированный H5N1 вирус является патогенным для мышей, именно эти  животные были использованы как модель иммунной системы млекопитающих  для исследования летальной инфекции птичьего гриппа.

Производство вакцины  против вируса гриппа H5N1 в системе  куриных эмбрионов невозможно из-за гибели куриных эмбрионов при  заражении этим вирусом и высоком  уровнем биобезопасности, необходимым  для работы с этим вирусом и  производством вакцины на основе этого вируса. Для разработки вакцины  на основе цельного вируса использовались авирулентный вирус H5N4, выделенный от мигрирующих уток, вирус H5N1 и авирулентный рекомбинантный вирус H5N1. Все вакцины  были инактивированы формалином. Интраперитональная иммунизация мышей каждой вакциной вызывала выработку гемагглютинин-ингибирующих и вирус-нейтрализующих антител, в  то время как интраназальная вакцинация без адьюванта индуцировала как  мукозальный, так и системынй  антительный ответ, который защищал  мышей от контрольного заражения  летальным вирусом H5N.

Интрамускулярное введение вакцины, приготовленной на основе непатогенного  штамма A/Duck/Singapore-Q/F119-3/97 (H5N3), антигенно  связанного с человеческим вирусом H5N1, в сочетании с квасцами или  без них, приводило к полной защите от летального контрольного заражения  вирусом H5N1. Защита от инфекции наблюдалась  у 70% животных, которым вакцина вводилась  сама по себе и у 100% животных, которым  вакцина вводилась в сочетании  с квасцами. Протективный эффект вакцинации коррелировал с уровнем вирус-специфических  сывороточных антител. Эти результаты говорят о том, что в случае пандемии возможно использование антигенно  связанных, но не патогенных вирусов  гриппа в качестве кандидатов в вакцину.

Исследования ДНК вакцин показали, что ДНК вакцина, кодирующая гемагглютинин из A/Ty/Ir/1/83 (H5N8), который  отличается от A/HK/156/97 (H5N1) в пределах 12% в НА1, предотвращает гибель мышей, но не заболевание при инфицировании H5N1. Следовательно, ДНК вакцина, сделанная  на основе гетерологичного штамма Н5 не защищает мышей от инфицирования вирусом птичьего гриппа H5N1, но полезна при защите мышей от гибели.

Противогриппозные вакцины, индуцирующие значительный перекрестный гетеросубтипный иммунитет, могут  преодолеть ограничения эффективности  вакцин, вызванные антигенной вариабельностью  вируса гриппа А. Мыши, получившие трехкратную  интраназальную иммунизацию вакциной H3N2 в сочетании LT(R192G), были полностью  защищены при летальном контрольном  инфицировании высокопатогенным человеческим вирусом H5N1, причем вирусные титры в  носовой полости и легких были по крайней мере в 2500 раз ниже, чем  у контрольных мышей, получавших только LT(R192G). Напротив, мыши, которые  получили трехкратную вакцинацию вакциной H3N2 подкожно в присутствии или  отсутствии LT(R192G) или неполного адьюванта  Фрейнда, не были защищены при летальном  контрольном инфицировании и  никакого заметного снижения титров вируса в тканях не наблюдалось на 5 день после контрольного инфицирования  вирусом H5N1. Вакцинация без LT(R192G) приводила  лишь к частичной защите против гетеросубтипного контрольного заражения. Результаты исследования гетеросубтипного иммунитета подтвердили  полезность мукозальной вакцинации, которая стимулирует перекрестную защиту против множества вирусных субтипов, включая вирусы, представляющие потенциальную  пандемическую опасность.

       Разработка  средств обнаружения и диагностики

Во время вспышки 1997 года анализ ингибирования гемагглютинации, стандартный для серологического  определения инфекции гриппа у человека, показал низкую чувствительность при  определении антител к вирусу птичьего гриппа. В связи с этим, для определения антител к  вирусу птичьего гриппа у человека был предложен более чувствительный метод микронейтрализации и Н5 специфический  непрямой ELISA (иммуноферментный анализ). Чувствительность и специфичность  этих методов была сравнима и, кроме  того, значительно увеличивалась  при сочетании с Вестерн-блотом. Максимальная чувствительность (80%) и  специфичность (96%) при определении  анти Н5 антител у взрослых в возрасте от 18 до 59 лет достигалась при  применении микронейтрализации в сочетании  с Вестерн блотом, а максимальная чувствительность (100%) и специфичность (100%) при определении анти Н5 антител  в сыворотке детей моложе 15 лет  достигалась при применении ELISA в  сочетании с Вестерн блотом. Этот алгоритм может использоваться при  проведении сероэпидемиологических исследований вспышек птичьего гриппа H5N1.

Было также показано, что  высокопатогенные нейротропные варианты вируса птичьего гриппа H5N1 могут быть быстро выделены на мышах.

Кроме того, еще в 1995 году для быстрого определения последовательности сайта расщепления гемагглютинина, маркера потенциала вирулентности  вирусов птичьего гриппа, была использована RT-PCR (полимеразная цепная реакция). Эта  методика в сочетании с сиквенсом  сайта расщепления гемагглютинина может служить в качестве быстрого и чувствительного метода оценки потенциальной вирулентности вирусов  птичьего гриппа. Раннее обнаружение  связанных с вирулентностью последовательностей  на сайте расщепления гемагглютинина в полевых изолятах вируса поможет  лучше контролировать грипп среди  огромной популяции домашней птицы.

В дальнейшем был разработан простой молекулярный метод быстрого генотипирования для мониторинга  внутренних генов циркулирующего вируса гриппа А. Стратегия субтипирования вируса была протестирована вслепую  на 10 контрольных вирусах каждого  субтипа H1N1, H3N2 и H5N1 (всего на 30) и обнаружила высокую эффективность. Стандартизованный метод генотипирования использовался для идентификации источника внутренних генов 51 вируса гриппа А, выделенного от людей в Гонконге в ходе вспышек 1997-1998 годов и сразу после них. Эта же методика использовалась для характеристики внутренних генов двух изолятов вируса птичьего гриппа H9N2, полученных в Гонконге в 1999г.

Позднее был разработан real-time reverse transcriptase PCR (RRT-PCR) анализ для быстрого определения вируса гриппа А и  субтипов Н5 и Н7 вируса гриппа А. В  этом анализе используется одностадийный  способ определения и флуоресцентные зонды. Предел определения - около 1000 копий  мишени-РНК. С помощью этого метода можно определить 0,1 50%-ную инфекционную дозу для куриных эмбрионов. Для  анализа субтипов вируса гриппа А  предел определения - 103-104 копии мишени-РНК. Чувствительность и специфичность  данного метода напрямую сравнивалась со стандартными методиками для определения  вируса гриппа: выделение гриппа на куриных эмбрионах и субтипирование гемагглютинина в реакции ингибирования  гемагглютинации. Сравнение проводилось  на 1550 трахеальных и клоачных мазках от различных видов птиц и мазков, взятых из окружающей среды на рынках живой птицы в Нью-Йорке и  Нью-Джерси. Результаты RRT-PCR коррелировали  с результатами выделения гриппа на куриных эмбрионах в 89% образцов. Остальные образцы были положительными при определении только одним  из методов. В целом чувствительность и специфичность Н7- и Н5-специфичных  анализов была сходна с методом выделения  вируса на куриных эмбрионах и  реакции ингибирования гемагглютинации.

       Лечение  заболевания

Исследования, проводимые до сих пор, подтверждают, что назначение лекарств, разработанных для штаммов  человеческого гриппа, будут эффективны и в случае инфекции птичьего гриппа у человека, однако не исключена  возможность, что штаммы гриппа могут  стать резистентными к таким  лекарствам и эти лекарства станут неэффективными.

Было обнаружено, что выделенный вирус чувствителен к амантадину и римантадину, ингибирующим репродукцию  вируса гриппа А и применяемым  в терапии человеческого гриппа. Кроме того, был исследован ряд  других препаратов. Ингибитор нейраминидаз занзивир ингибировал репликацию вирусов  на клетках почек хомяков в  анализе вирусного урожая (50% эффективная  концентрация, 8,5-14,0 mM) и ингибировал  активность вирусной нейраминидазы (50% ингибирующая концентрация 5-10 nM). Интраназальное введение занзивира дважды в день (50 и 100 mg/kg веса тела) полностью защищало мышей от смерти. В дозе 10 mg/kg веса занзивир полностью защищал мышей  от инфицирования вирусом H9N2 и увеличивал продолжительность жизни и количество выживших мышей, инфицированных вирусами H6N1 и H5N1. Во всех исследованных дозах  занзивир значительно уменьшал титры  вируса в легких и полностью блокировал распространение вируса в мозг. Таким  образом, занзивир является эффективным  при лечении птичьего гриппа, который  может быть перенесен на млекопитающих.

Орально вводимый ингибитор  нейраминидазы RWJ-270201 был протестирован  в параллели с занамивиром (zanamivir) и озелтамивиром (oseltamivir) на панели вирусов  птичьего гриппа на ингибирование нейраминидазной  активности и репликации в тканевых культурах. Затем эти агенты были протестированы на защиту мышей против летальных инфекций H5N1 и H9N2. In vitro, RWJ-270201 был наиболее эффективным против всех девяти субтипов нейраминидазы. RWJ-270201 (концентрация 50% ингибирования от 0,9 до 4,3 nM) превосходил занамивир и  озельтамивир карбоксилат по ингибированию  нейраминидазы. RWJ-270201 ингибировал репликацию вируса птичьего гриппа как евразийской, так и американской линии на клетках MDCK (концентрация 50% эффективности от 0,5 до 11,8 mM). Мыши, которым ежедневно давали RWJ-270201 из расчета 10 mg на кг веса были полностью защищены против контрольного заражения летальной дозой вирусов A/Hong Kong/156/97 (H5N1) и A/quail/Hong Kong/G1/97 (H9N2). Как RWJ-270201, так и озельтамивир значительно уменьшали титры вирусов в легких мышей при дневных дозах от 1,0 до 10 mg/kg и защищали распространение вируса в мозг. Когда лечение начиналось через 48 часов после экспозиции вирусом H5N1, 10 mg RWJ-270201/kg веса ежедневно защищали 50% мышей от гибели. Эти результаты подтвердили, что RWJ-270201 эффективен против вируса птичьего гриппа по крайней мере также, как и занамивир или озельтамивир и потенциально может использоваться в клинической практике для лечения птичьего гриппа при переносе его от птиц к человеку.