Эпизоотологические особенности инфекционного ринотрахеита кошек в условиях города Благовещенска

       При вскрытии трупа в зависимости  от формы и стадии течения лейкоза обнаруживают значительные изменения (в виде диффузной или очаговой инфильтрации) в органах кроветворения, пищеварения, на серозных покровах, в сердце, печени, почках и в матке.

       Основными формами ЭЛ КРС считаются собственно лейкозы и ретикулозы. К собственно лейкозам относят лимфо- и миелолейкоз, гемобластоз, а к ретикулозам – лимфо- и ретикулосаркому, системный ретикулоз, лимфогрануломатоз и плазмоцитому. Эта классификация ЭЛ КРС основана на патоморфологической характеристике разрастаний (новообразований), результатов цитологического и гематологического исследований циркулирующих в крови клеточных элементов (степени их созревания). Для патогистологического исследования направляют от павших или убитых животных кусочки (2x2 см) измененных органов, фиксированных 10 %-ным раствором формалина. При ЭЛ КРС наблюдают в органах характерные изменения, в первую очередь – лимфоидно-клеточную инфильтрацию.

1.5 Диагностика и дифференциальная диагностика

       Диагноз. ЭЛ КРС диагностируют на основании  эпизоотологического, клинйкогематологического, серологического, вирусологического, патологоанатомического исследований с обязательным проведением гистологического исследования.

       При гематологическом исследовании на Л  КРС используют различные критерии, названные «лейкозными ключами». Определяют отклонение от нормы число лейкоцитов, молодых клеток, абсолютное и процентное количества лимфоцитов. Однако по мере развития патологического процесса число лейкоцитов и лимфоцитов у животных иногда даже может быть ниже нормы. Кроме того, в 8-40% случаев ЭЛ КРС может протекать алейкемически (число лейкоцитов 5,5-9,5 тыс/мкл). Все животные, у которых установлен персистентный (длительный) лимфоцитоз (ПЛЦ), являются носителями ВЛ КРС, но не у всех инфицированных вирусом животных развивается ПЛЦ. Процент случаев ЭЛ КРС (инфекции ВЛ КРС) без ПЛЦ бывает в пределах 15-72%. Поэтому с помощью лейкозного ключа выявляют не всех больных ЭЛ КРС, а только животных с гематологическими изменениями.

       Для выделения вирусов животных используют иммунологические методы исследования: в геле (РИД), метод иммунофлюоресценции (РИФ), РСК, радиоиммуьологический и др. Они позволяют выявить распространение ВЛ КРС в стадах и способствуют ранней диагностике болезни. Из этих методов по простоте постановки реакции более широкое практическое применение нашла РИД, основанная на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к глюкопротеидному и полипептидному антигенам ВЛ КРС

       Животные  реагируют серологически положительно через 2-4 мес после инфицирования ВЛ КРС. Антитела выделяются молозивом и молоком, и их можно установить у телят до 6-месячного возраста. Поэтому диагностическое значение у молодняка имеют антитела, обнаруживаемые с 6-месячного возраста. Вспомогательными методами диагностики ЭЛ КРС считаются исследования пунктата грудной кости, лимфоузлов, биопсия печени и селезенки.

       Дифференциальный  диагноз Необходимо исключить СЛМ и болезни, сопровождающиеся сходными с ЭЛ КРС изменениями в составе крови. СЛМ отличается от ЭЛ КРС по этиологии. Возбудителем СЛМ не является ВЛ КРС. При СЛМ не образуются антитела против ВЛ КРС, не возникает ПЛЦ, отмечается спорадическое распространение, острое или подострое течение и заболевание молодняка.

       Необходимо  учитывать, что многие остро и  хронически протекающие болезни (туберкулез, бруцеллез, паратуберкулез, антиномикоз, некоторые инвазионные болезни, травматический перикардит, ретикулит, метриты, маститы, гепатиты и др.) нередко сопровождаются значительными изменениями крови, которые имеют защитный характер и определяются как лейкемоидная реакция организма (ЛР), отражающая функционально-реактивные изменения.

       Изменения крови при лейкозе носят органический характер. ЛР является временной, исчезает она с улучшением состояния животного. Для исключения указанных болезней проводят соответствующие микробиологические, серологические, аллергические, гистологические, копрологические, повторные гематологические и другие исследования.

       СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ  МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

       1. Сущность метода – выявление при помощи РИД в сыворотке крови животных специфических преципити-рующих антител к ВЛКРС.

       Пробы крови для исследований берут  не ранее чем через 15 суток после  введения животным вакцин или аллергенов, за 30 суток до отела и спустя такой же срок после него.

       Специфические антитела появляются в крови через 1-2 мес после заражения вирусом лейкоза и сохраняются пожизненно.

       Серологическому исследованию на лейкоз подвергают сыворотки  крови от животных в возрасте 6 мес. и старше.

2. Для постановки РИД используют диагностический набор, который состоит из специфического антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота, специфической преципитирующей сыворотки к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, отрицательной сыворотки и других компонентов. К набору прилагается наставление по его применению для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
3. Испытуемые сыворотки получают из крови исследуемого животного в количестве 2-3 мл и направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают название хозяйства, номер  (кличку), возраст, пол, породу животного.

       Кровь (для получения сыворотки) берут  в бактериологические пробирки, выдерживают 1-2 ч в теплом месте (не выше 40 °С). Для лучшего отделения сыворотки образовавшийся сгусток обводят в пробирке, профломбированной после каждой пробы стальной спицей (проволокой). После этого пробирки выдерживают в течение 20-24 ч при 4-10°С. Полученные пробы сыворотки сливают в пробирки Флоринского (достаточно по 2-3 мл) и маркируют.

       При невозможности быстрого исследования подготовленные пробы сыворотки  можно хранить в замороженном состоянии или консервировать борной кислотой (2-4 % к объему, до образования на дне пробирки осадка кристаллов).

       2.4. Оборудование и реактивы. Для постановки РИД требуются:

• чашки Петри или стеклянные пластины размером 6x9 или 9x12 см;
• стандартный штамп-пробойник для просечения лунок в агаре;
• пастеровские пипетки;
• потенциометр (рН-метр);
• осветитель;
• агар Дифко (или агар-порошок, ГОСТ 17006 – 84);
• буфер 0,05 М Трис-НС1, рН 7,2;
• хлорид натрия (х.ч.);
• дистиллированная вода;
• соляная кислота (концентрированная, х.ч.).

       2.5. Постановка РИД.

       2.5.1. Компоненты реакции и подготовка их к работе. Лиофилизированный антиген, специфическую преципитирующую и отрицательную сыворотки растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке. Растворенные диагностикумы можно хранить при температуре 4°С не более двух недель.

       Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50-65°С, разливают слоем 2-3 мм в обезжиренные чашки Петри или на стекла, установленные в горизонтальном положении, и оставляют их при комнатной температуре на 1 ч.

        В затвердевшем агаре с помощью штампа-пробойника прорезают лунки для тест-систем – для каждой тест-системы требуется семь лунок диаметром 5-7 мм: одна в центре и шесть по периферии, расстояние между лунками соответственно 2,5-3 мм (рис. 2).

       2.5.2. Лиофилизированный антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносят в лунки пастеровскими пипетками, которые для каждого диагностикума должны быть отдельные. Пипетки для испытуемых сывороток промывают после каждой пробы. Лунки заполняют доверху, не допуская переливания жидкости через край.

       Антиген вносят в центральную лунку, две  диаметрально противоположные лунки  заполняют специфической.

       После заполнения лунок чашки Петри выдерживают 48 ч при температуре 18-27°С (стеклянные пластинки – при той же температуре во влажной камере) (рис. 4).

       2.6. Учет и оценка результатов реакции.

1. Реакцию учитывают через 48 ч в проходящем свете и оценивают при наличии четкой контрольной линии преципитации между антигеном и специфической преципитирующей сывороткой и отсутствии таковой с отрицательной контрольной сывороткой (рис. 5).
2. При оценке результатов реакции с испытуемыми сыворотками прежде всего устанавливают специфичность образовавшихся линий преципитации.

       Специфической считают линию преципитации, которая  образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном и соединяется с контрольной линией преципитации, то есть идентична ей (рис. 6).

       Неспецифической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя угол.

        2.6.3. В зависимости от наличия специфических антител против ВЛКРС и типа получившихся линий преципитации реакцию  оценивают как положительную или отрицательную.

       2.7. Реакцию считают положительной, если между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном:

• образуется линия преципитации, которая соединяется с контрольной линией и идентична ей (см. рис. 6);
• линия преципитации отсутствует, но контрольная полоса образует изгиб вблизи лунки с испытуемой сывороткой к лунке с антигеном;
• кроме специфической линии преципитации, образуется дополнительная линия, которая располагается ближе к лунке с испытуемой сывороткой и обусловлена наличием антител к полипептидному антигену р24 ВЛКРС (см. рис. 6).

       2.8. Реакцию считают отрицательной, если контрольная линия преципитации продолжается до лунки с испытуемой сывороткой без изгибов.

       2.9. При наличии слабо различимого изгиба линии преципитации у лунки с испытуемой сывороткой животное исследуют вновь через три-четыре недели.

       В случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется  зона опалесценции вокруг лунок, реакцию  следует переставить.

       При сдвиге контрольной линии преципитации в сторону лунок с антигеном  необходимо провести проверку компонентов  реакции на активность в контрольной  тест-системе.

       2.10. Животных, сыворотки к рови которых дали положительный результат в РИД, считают зараженными вирусом лейкоза, и их необходимо исследовать гематологическим методом.

       3. ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

       Метод заключается в количественной и  качественной оценке лейкоцитов периферической крови животных, отнесенных по результатам  РИД к группе инфицированных ВЛКРС.

       При гематологическом исследовании осуществляют:

• подсчет количества лейкоцитов при помощи электронного счетчика частиц или в камере Горяева;
• дифференцированный подсчет лейкоцитов в мазках (выведение лейкоформулы) или лимфоцитов при помощи фазово-контрастного микроскопирования крови в камере Горяева;
• оценку количества лейкоцитов и абсолютного количества лимфоцитов по "лейкозному ключу" (постановку гематологического диагноза).

       3.1. Для количественной и качественной оценки лейкоцитов берут пробы крови в пробирки с антикоагулянтом. В качестве антикоагулянта используют трилон-Б (ЭДТА – динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) из расчета одна капля 10%-ного раствора (на дистиллированной воде) на 1 мл крови. Можно использовать гепарин из расчета 5 БД на 1 мл крови или 6%-ный раствор лимоннокислого натрия (одна капля на 1 мл крови).

       Для предотвращения свертывания крови  пробирки сразу же (не отходя от исследуемого животного) закрывают резиновой  пробкой и тщательно перемешивают, переводя попеременно пробирку из вертикального  положения в горизонтальное.

       Пробы крови должны быть исследованы не позднее 36 ч с момента взятия.

       3.2. Определение количества лейкоцитов.

       3.2.1. Подсчет количества лейкоцитов  при помощи электронного счетчика  частиц гипа"Целлоскоп", "Культер", "Пикоскел" выполняют в соответствии  с наставлением (инструкцией) по их эксплуатации.