Эпизоотологические особенности инфекционного ринотрахеита кошек в условиях города Благовещенска

       Для проведения исследования готовят следующие  растворы:

• раствор электролита – в 10 л дистиллированной воды растворяют 90 г хлористого натрия (х.ч.), 5 г трилона-Б, 10 мл 40 %-ного нейтрального формалина. Фильтруют его через 5-6 слоев фильтровальной бумаги. Индикаторной бумагой контролируют рН раствора, путем добавления трис-буфера доводят его до 6,0-7,2 (включая случаи, когда рН ниже 6,0);
• для лизиса эритроцитов используют 1 %-ный водный раствор сапонина, смешивая его в соотношении 1000:5 с 35 %-ным раствором формальдегида. Сразу после приготовления раствор фильтруют, разливают в небольшие флакончики и хранят в замороженном виде. Срок хранения до 3 мес.
• При работе со счетчиками французского производства "Культер-Каунтер" готовят только один раствор, добавляя на 10 л раствора электролита 2 г белого сапонина.

       3.2.2. Подсчет лейкоцитов в камере  Горяева. В пробирки Флоринского  или в лунки полистироловых  пластин разливают по 0,4 мл жидкости Тюрка. Состав жидкости Тюрка следующий: ледяная уксусная кислота 1-3 мл, 1 %-ный водный раствор метиленового синего или генци-анвиолета, дистиллированная вода до 100 мл.

       Стеклянным  капилляром набирают предварительно перемешанную кровь до метки 0,02 мл (20 мм³). Марлевой салфеткой протирают наружную поверхность капилляра от крови и плавно выдувают содержимое на дно пробирки (лунки) с жидкостью Тюрка. Несколько раз капилляр промывают, насасывая и выдувая содержимое пробирки (лунки).

       Для следующего этапа работы готовят  камеры Горяева, притирают к ним (со стороны сетки) шлифованные стекла (из комплекта камеры Горяева). Можно с успехом использовать шлифованные кварцевые стекла размером 26x24x3 мм из комплекта стандартных кювет, прилагаемого к фотоэлектроколориметрам отечественного про изводства.

       В подготовленную для работы камеру Горяева  при помощи глазной пипетки вносят разведенные в жидкости Тюрка (предварительно пропипетировав) пробы крови от двух животных. Для удобства учета проб в верхнюю половину вносят нечетные, а в нижнюю – четные пробы. Если в камере будут обнаружены пузырьки воздуха, то ее перезаряжают вновь. Выждав 1-2 мин, пока клетки осядут, их подсчитывают под микроскопом при увеличении 10x10 или 10x20. Клетки подсчитывают в 25 больших квадратах (разделенных на 16 малых), начиная с левого верхнего угла сетки и далее сверху вниз (итого в пяти вертикальных рядах – по пять квадратов в ряду). В каждом квадрате считают клетки, находящиеся внутри, а также лежащие на левых и нижних линиях и в левых углах квадрата.

       Для подсчета содержания лейкоцитов в 1 мкл крови число подсчитанных в 25 квадратах клеток умножают на 200.

       При достаточном навыке врач-гематолог  может определять пробы заведомо нормальной крови, исходя из общей картины  распределения клеток в поле зрения микроскопа, оцененной визуально (без поклеточного подсчета) при однократном и достаточно быстром перемещении в вертикальном направлении всей сетки камеры Горяева. В этом случае в ведомости вместо количества лейкоцитов ставится индекс "N" (норма).

       Пробы, вызвавшие даже самое малое подозрение на лейкоцитоз, подлежат подсчету в 25 квадратах камеры, как указано выше.

       3.3. Дифференцированный подсчет лейкоцитов (выведение лейкоцитарной формулы)  проводят при обнаружении повышенного  количества их. Для этих целей  готовят мазки крови.

       3.3.1. Мазки крови (приготовление и фиксирование).

       3.3.1.1. Подготовка предметных стекол. Для  приготовления мазков крови используют чистые обезжиренные предметные стекла без царапин и шероховатостей. Новые стекла моют в теплой мыльной воде, затем в проточной, протирают тампоном, смоченным смесью спирта и эфира, а затем сухой салфеткой.

       Со  стекол, бывших в употреблении, удаляют  иммерсионное масло тампоном, смоченным  ксилолом или бензином, после чего их помещают на один-три дня в раствор двухромовой смеси (100 г двухромовокислого калия растворяют в 1 л горячей воды и постепенно приливают 100 мл концентрированной серной кислоты). Стекла промывают в проточной воде 1-2 сут, протирают сухой хлопчатобумажной тканью и заливают на 1-2 сут смесью спирта и эфира в равных частях. Затем стекла вновь насухо протирают чистой салфеткой и по 10-15 штук обертывают бумагой.

       3.3.1.2. Мазки готовят из стабилизированной  крови на обезжиренных предметных  стеклах. Для предотвращения возможного  травмирования клеток крови при  производстве мазков, особенно в холодное время года, рекомендуется предметные стекла слегка подогреть (до температуры тела).

       Для приготовления мазка стекло берут  в левую руку между большим  и указательным пальцами за короткие грани. Каплю крови наносят на правый конец стекла. Она должна быть такого размера, чтобы конец мазка, приготовленного из него, не доходил на 1 см до края стекла. Шлифованное стекло ставят впереди капли крови, надвигают до прикосновения с ней и равномерным движением влево делают мазок.

       Хорошо  приготовленный мазок должен быть тонким, ровным и при просмотре на свет отливать цветами радуги.

       После высушивания на воздухе мазки  маркируют простым карандашом или  иглой, указывая номер экспертизы, инвентарный  номер или кличку животного, дату приготовления мазка, и фиксируют в метиловом спирте 3-5 мин, этиловом спирте – 20-30, жидкости Никифорова (смесь равных частей этилового спирта и эфира) – 15-20 или ацетоне – 5 мин.

       3.3.2. Окраска мазков крови. Окраска  по Романовскому-Гимза. Окрашивают мазки в течение 20-30 мин краской Романовского – Гимзе в специальных ваннах (можно в чашках Петри). Затем краску многократно смывают дистиллированной водой и мазки высушивают на воздухе. Качество окраски контролируют под микроскопом. В правильно окрашенном мазке ядра клеток приобретают красно-фиолетовый цвет, цитоплазма лимфоцитов – голубой, а цитоплазма ней-трофилов – розовый.

       На  рис. 7 показаны лимфоидные клетки коровы при лимфолейкозе (окраска по Романовскому – Гимза).

       Окраска по Паппенгейму. Для ее проведения применяют две краски. Вначале нефиксированный мазок обрабатывают краской Май-Грюнвальда в течение 3 мин, а затем к красящему объему добавляют равное количество дистиллированной воды и в одерживают 2-3 мин, после чего мазок промывают и докрашивают по Романовскому – Гимза при экспозиции 10-15 мин. В препаратах крови, окрашенных этим методом, цветовые оттенки ядер и цитоплазмы, характерные для отдельных видов клеток, получаются отчетливее, чем при окраске по Романовскому – Гимзе.

       Окраска по Нохту. Предварительно готовят 0,1 %-ный водный раствор основной краски азур II и 0,1 %-ный раствор кислой краски желтого эозина и выдерживают их в течение двух недель. Перед окраской готовят свежий рабочий раствор, состоящий из двух частей раствора эозина, трех – раствора азура II и пяти частей дистиллированной воды. Красят мазки 20-25 мин. Цитоплазма окрашивается в светло-желтый цвет, ядро – в фиолетовый.

       3.3.3. Лейкоцитарную формулу выводят по результатам дифференцированного подсчета 100 клеток в окрашенных мазках крови под микроскопом с иммерсионной системой. При подсчете предметное стекло продвигают по зигзагообразной линии в направлении к концу мазка. Для счета дифференцированных клеток используют клавишный счетчик. Количество отдельных элементов крови в лейкоцитарной формуле выражают в процентах.

       3.3.4. Для подсчета абсолютного количества лимфоцитов, в пробе крови относительное их содержание (в %), определяемое по лейкоцитарной формуле, умножают на показатель абсолютного количества лейкоцитов в 1 мкл и полученное произведение делят на 100. Показатель абсолютного количества лимфоцитов оценивают затем по "лейкозному ключу", указанному в таблице.

       3.3.5, Дифференцированный подсчет количества  лейкоцитов можно производить  с помощью фазово-контрастного  микроскопирования крови в камере  Горяева. Для этого пробы с повышенным содержанием лейкоцитов микроскопируют с использованием фазово-контрастного устройства (отечественные марки КФ-4, КФ-5) при увеличении объектива 20^х или 40^х.

       3.3.5.1. Состав фазово-контрастного устройства. Основные части устройства – фазовые объективы и фазовый конденсор.

       Объективы для наблюдения методом фазового контраста отличаются от обычных  ахроматических только тем, что в  плоскости выходного зрачка объектива  нанесено фазовое кольцо, а на корпусе  выгравирована буква "Ф".

       Фазовый конденсор отличается от обычного наличием кольцевых диафрагм, помещенных в фокальной плоскости конденсора; диафрагмы вставляются в револьверный диск и применяются в соответствии с выбранным объективом. Конденсор может быть использован для наблюдения обычным способом; для этого в диске револьвера, кроме кольцевых диафрагм, имеется свободное отверстие для пропускания всего пучка света.

       Фазовый конденсор вставляется в кольцо кронштейна конденсоров микроскопа и зажимается винтом обычным способом.

       Кольцевые диафрагмы, в зависимости от применяемого объектива, сменяют поворотом револьверного диска за накатанную часть до фиксации, причем в окне кожуха конденсора должна появиться цифра, соответствующая увеличению применяемого объектива, или буква "О", соответствующая свободному отверстию.

       Два винта служат для центрировки  кольцевой диафрагмы относительно фазового кольца объектива.

       Вспомогательный микроскоп (МИР-4) применяют при центрировке  изображения кольцевой диафрагмы  конденсора относительно фазового кольца объектива. Вспомогательный микроскоп вставляют в тубус микроскопа вместо окуляра и после выполнения центрировки снова заменяют окуляром.

       3.3.5.2. Порядок работы. Вставить в револьвер  микроскопа фазово-контрастные объективы.

       Установить  в кольцо кронштейна конденсоров фазовый конденсор; при этом в окне кожуха конденсора должна быть буква "О".

       Поместить на предметный столик препарат  (заряженную камеру Горяева) и сфокусировать  микроскоп на сетку камеры.

       Настроить осветитель по правилам нормального  освещения.

       Открыть полностью ирисовую диафрагму конденсора.

       Вставить  вместо окуляра вспомогательный  микроскоп и, перемещая его окуляр боковым винтом, сфокусировать на фазовое кольцо объектива.

       Включить  вращением револьверного диска  конденсора требуемую кольцевую  диафрагму; при этом в окне кожуха конденсора должна появиться цифра, соответствующая увеличению выбранного объектива, а во вспомогательном микроскопе, помимо фазового кольца, видно светлое кольцо диафрагмы.

       Совместить  с помощью центрировочных винтов светлое кольцо с темным кольцом. Если светлое кольцо остается шире темного, передвижкой конденсора по высоте следует добиться, чтобы оно полностью вписывалось в темное кольцо.

       Снять вспомогательный микроскоп и  заменить его обычным окуляром.

       Для достижения большей контрастности рекомендуется пользоваться цветным светофильтром. После смены объектива необходимо заново проверить центрировку изображения кольцевой диафрагмы относительно фазового кольца.

       Фазово-контрастное  микроскопирование проб крови при  увеличении объектива 20^х или 40^х позволяет достаточно надежно дифференцировать лимфоциты от остальных лейкоцитов (рис. 8).

       Фазово-контрастное  микроскопирование проб крови в  камере Горяева позволяет достаточно надежно дифференцировать лимфоциты  от остальных лейкоцитов. Ядра лимфоцитов правильной округлой формы, неблестящие, структура хроматина вы глядит мелкосетчатой, более плотная к центру. Ядра нейтрофйлов – неправильной формы, блестящие. Другие лейкоциты (эозинофилы, моноциты и пр.) также достаточно четко отличаются от лимфоцитов.

       Производят  дифференцированный подсчет лимфоцитов и отдельно – всех остальных лейкоцитов в 25 больших квадратах камеры Горяева. При этом можно пользоваться клавишным счетчиком лейкоцитов: на каждую пробу отводят по две клавиши (одну для лимфоцитов, другую для всех остальных клеток – нелимфоцитов). Общее число клеток (лимфоциты+нелимфоциты), а также число только лимфоцитов, подсчитанных в 25 квадратах, умножают на 200 и получают соответственно показатель абсолютного содержания лейкоцитов и лимфоцитов в 1 мкл крови. Эти значения затем оценивают по "лейкозному ключу" (см. таблицу в п. 3.3.4)