Липаза коровьего молока: строение, функции

Активность ферментов  выражают в стандартных единицах Е, которые соответствуют количеству фермента, катализирующего превращение субстрата со скоростью 1 мкмоль в 1 мин при стандартных условиях. Более новая единица — катал (кат), соответствующая количеству фермента, катализирующего превращение субстрата со скоростью 1 моль в 1 с (1 кат = 6 • 10⁷ Е).

Таблица 1.7 Основные ферменты, играющие важную роль при производстве молочных продуктов [3].

В таблице 1.7 представлены основные нативные ферменты 1-го и 3-го классов, знание свойств которых очень важно для специалистов молочной промышленности.

Наряду со свойствами отдельных  представителей ферментов этих двух классов, я рассмотрела также  некоторые ферменты других классов.

• Оксидоредуктазы

К оксидоредуктазам относятся  разнообразные пиридиновые и  флавиновые дегидрогеназы, оксидазы, лактопероксидаза и каталаза.

Д е г и д р о  г е н а з ы. В молоке обнаружено небольшое количество нативных дегидрогеназ: лактатдегидрогеназа (Н.Ф.1.1.1.27), пируватдегидрогеназа (Н.Ф. 1.2.4.1), цитохром с-редуктаза (Н.Ф. 1.6.99.3) и др. Они являются компонентами клеток и катализируют дегидрирование соответствующих субстратов. При этом перенос атомов водорода осуществляют пиридиновые (НАД и НАДФ) и флавиновые (ФАД и ФМН) коферменты, например:

Многочисленные дегидрогеназы (редуктазы) накапливаются в сыром  молоке при размножении в нем  бактерий. Они могут вызывать ухудшение органолептических свойств молока.

Активность редуктаз и  бактериальную обсемененность молока можно определить по продолжительности  восстановления (обесцвечивания) добавленного к молоку метиленового голубого или резазурина (редуктазная проба, ГОСТ 9225—84).

Дегидрогеназы, вырабатываемые молочнокислыми бактериями и дрожжами заквасок, принимают активное участие  в молочнокислом и спиртовом  брожениях. Так, образование молочной кислоты из пировиноградной происходит с участием лактатдегидрогеназы, образование спирта из уксусного альдегида — с участием алкогольдегидрогеназы.

О к с и д а з  ы. К оксидазам молока относятся  ксантиноксидаза, вырабатываемая клетками молочной железы, а также оксидазы аминокислот (дезаминирующие), глюкозооксидаза и другие ферменты, продуцируемые микрофлорой молока.

Ксантиноксидаза является ФАД-содержащим ферментом, катализирует окисление молекулярным кислородом пуриновых оснований — гипоксантина и ксантина — до мочевой кислоты, а также различных альдегидов (ацетальдегида и др.) до соответствующих карбоновых кислот:

 

 

 

Считают, что в молоке и молочных продуктах ксантиноксидаза  быстрее окисляет альдегиды, чем  пурины. Образующийся при этом пероксид водорода обладает бактерицидным действием  и может активировать антибактериальную лактопероксидазную систему.

В коровьем молоке фермент  находится в оболочках жировых  шариков (женское молоко не содержит ксантиноксидазу).

Ксантиноксидаза молока выделена в кристаллическом виде, фермент содержит железо и молибден, является димером с молекулярной массой около 300 000, имеет оптимум рН 5,2-9,0, достаточно термостабилен. Его содержание в коровьем молоке довольно высокое и составляет 50-160 мг/л. Активность ксантиноксидазы небольшая, но увеличивается к концу периода лактации, после гомогенизации и липолиза молока. Некоторые авторы связывают образование окисленного привкуса в молоке с активностью ксантиноксидазы.

Лактопероксидаза. Нативная пероксидаза коровьего молока (лактопероксидаза) синтезируется клетками молочной железы. Небольшая часть пероксидазы (миелопероксиды) может освобождаться из лейкоцитов. Лактопероксидаза выделена в кристаллическом виде, фермент является димером, имеет молекулярную массу 82000, оптимум действия при рН 6,8 и температуре 20-25°С; содержится в молоке в больших количествах (30-100 мг/л), имеет высокую активность (около 370 нкат).

Лактопероксидаза устойчива  в кислой среде, довольно термостабильна, инактивируется при температуре выше 80°С, обладает способностью к реактивации.

Фермент катализирует окисление  различных органических соединений пероксидом водорода:

Он может окислять и  некоторые неорганические соединения, например иодид калия:

Данную реакцию используют в молочной промышленности для контроля эффективности высокотемпературной  пастеризации молока (проба на пероксидазу, ГОСТ 3623—73).

Ценным свойством лактопероксидазы является участие в создании антибактериальной системы (ЛП-системы), которая несколько сдерживает рост молочнокислых бактерий заквасок, но подавляет развитие грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella и др.

ЛП-система содержит три  компонента — лактопероксидазу, Н₂О₂ и тиоцианат. Тиоцианат (SCN^-) образуется в молоке из тиосульфата и цианида под действием фермента роданезы.

Второй компонент системы (Н₂0₂) является продуктом метаболизма молочнокислых и других бактерий, а также образуется при действии ксантиноксидазы.

При взаимодействии всех трех компонентов происходит окисление тиоцианата с образованием гипотиоцианата (OSCN^-), являющегося сильным окислителем, который система использует для атаки бактерий, при этом повреждается их внутренняя мембрана, подавляется синтез белков, ДНК и РНК, а затем наступает лизис клеток.

Для увеличения срока хранения сырого (и пастеризованного) молока антибактериальную ЛП-систему можно  активировать путем добавления в  сырье незначительного количества тиоцианата и пероксида водорода.

Каталаза. Нативная каталаза переходит в молоко из клеток молочной железы. Фермент также вырабатывают содержащиеся в молоке бактерии и лейкоциты. Каталаза является димером с молекулярной массой около 225000, оптимум действия фермента находится при рН 7-8 и температуре 20-40°С (хотя фермент начинает действовать уже при 0°С); инактивирование фермента происходит при нагревании молока до 75-80°С в течение 20-25 с.

Количество каталазы в  молоке непостоянно. В свежем коровьем молоке, полученном от здоровых животных, каталазы содержится мало. В молозиве и в молоке, полученном от больных  животных или бактериально загрязненном, ее количество резко увеличивается. Поэтому определение активности каталазы используют как метод обнаружения анормального молока и выявления его обсемененности психротрофной и гнилостной микрофлорой.

Каталаза катализирует окисление  пероксида водорода:

 

Контроль активности каталазы молока основан на определении количества кислорода, выделившегося из определенного  объема молока пероксидом водорода, или на измерении количества разложившегося пероксида водорода ферментом, содержащимся в 1 см³ молока за 1 мин при 25°С.

• Гидролазы.

В молоке обнаружены липазы, липопротеидлипаза, фосфолипазы, фосфатазы, β-галактозидаза, амилазы, лизоцим, протеазы и некоторые другие гидролитические ферменты.

Ф о с ф о л и п а з ы А₁, А₂ С и D. Катализируют гидролиз фосфолипидов, например лецитина, с образованием различных продуктов:

Фосфолипаза A₁ (Фл-1) катализирует гидролитическое отщепление ацильной группы в 1-ом положении. Фосфолипаза А₂(Фл-2) отщепляет вторую ацильную группу. Фосфолипаза С (Фл-3) вызывает гидролиз связи между фосфорной кислотой и глицерином, при этом образуются фосфорилхолин и диацилглицерин. Фосфолипаза D (Фл-4) отщепляет азотистое основание, и продуктом гидролиза оказывается фосфатидная кислота.

Нативные фосфолипазы  молока имеют незначительную активность, более активны фосфолипазы микробного происхождения, продуцируемые бактериями родов Pseudomonas, Bacillus, Clostridium и др. При их развитии молоко может приобрести «окисленный» и «рыбный» привкусы.

В настоящее время фосфолипазная  активность молочнокислых бактерий заквасок хорошо изучена. Высокая активность характерна для Leu. cremoris, средняя — для Lac. lactis и Lac. diacetylactis; низкая — для Lac. cremoris. Пропионовокислые бактерии обладают сравнительно высокой фосфолипазной активностью. Так, около 47,5% всех изученных штаммов, по данным М. С. Уманского [10], показали высокий уровень активности, 15,3% — средний и 37,2% — низкий. Продукты гидролиза фосфолипидов, по-видимому, принимают участие в формировании вкуса сыров.

К группе эстераз относится арилэстераза (Н.Ф.3.1.1.2), которая гидролизует ароматические эфиры карбоновых кислот, но на молочный жир не действует. Карбоксилэстераза (Н.Ф.3.1.1.1) гидролизует ароматические и алифатические эфиры карбоновых кислот, то есть способна гидролизовать молочный жир. Холинэстераза (Н.Ф.3.1.1.8) действует на эфиры холина, ароматические и алифатические эфиры карбоновых кислот. Нормальное молоко содержит мало эстераз. Однако большое количество арилэстеразы отмечено в молоке, полученном от больных маститом животных.

Ф о с ф а т а  з ы. В свежевыдоенном молоке обнаружены щелочная фосфатаза (с оптимум рН 9,6) и незначительное количество кислой фосфатазы (или фосфопротеидфосфатазы) с оптимумом рН около 5, а также рибонуклеаза, неорганическая пирофосфатаза и АТФаза.

Щелочная фосфатаза попадает в молоко из клеток молочной железы, но может вырабатываться микрофлорой молока (Е. coli, Вас. cereus, Вас. mycoides и др.). Она концентрируется главным образом на оболочках шариков жира и частично связана с белками.

Кислая фосфатаза связана в основном с белками и незначительно—с оболочками жировых шариков. Активность фермента по сравнению со щелочной фосфатазой незначительна. Структура щелочной и кислой фосфатаз до конца не выяснена. Оба фермента катализируют гидролиз большого числа различных эфиров фосфорной кислоты с образованием неорганического фосфата:

 

Щелочная фосфатаза молока чувствительна к повышенной температуре — полностью инактивируется при нагревании до 63°С в течение 30 мин, а также при кратковременной и моментальной пастеризации (при 72-85°С), кислая фосфатаза термостабильна. Высокая чувствительность щелочной фосфатазы к нагреванию положена в основу метода контроля эффективности пастеризации молока и сливок (фосфатазная проба, ГОСТ 3623—73).

Известно, что нативная фосфатаза  молока может восстанавливать свою активность после кратковременной  высокотемпературной пастеризации. Поэтому в спорных случаях необходимо проводить дифференцированное определение реактивированной и остаточной фосфатазы.

Рибонуклеаза (Н.Ф.3.1.27.5). Фермент катализирует расщепление рибонуклеиновой кислоты на нуклеотиды. Рибонуклеаза А молока по аминокислотному составу и свойствам аналогична рибонуклеазе поджелудочной железы, фермент попадает в молоко из крови.

Из молока выделен активный фактор роста сосудов — ангиогенин (от греч. angeion — сосуд), имеющий структурную гомологию с пакреатической рибонуклеазой и обладающий бактерицидным действием.

Г л и к о з и  д а з ы (Н.Ф.3.2). К ним относятся (β-галактозидаза, амилазы, лизоцим и др.

β-Галактозидаза, или лактаза. β-Галактозидаза катализирует реакцию гидролитического расщепления лактозы на моносахариды (галактозу и глюкозу). Клетки молочной железы лактазу практически не синтезируют, ее вырабатывают молочнокислые бактерии и некоторые дрожжи. Фермент имеет оптимум действия при рН 5 и температуре 40°С.

В последние годы возрос интерес к ферментативному гидролизу  лактозы в молоке и молочной сыворотке. Для обработки сыворотки часто  применяют иммобилизованную β-галактозидазу.

С помощью β-галактозидазы можно превратить плохо растворимый молочный сахар в некристаллизуемую и хорошо сбраживаемую смесь глюкозы и галактозы. Для этой цели фермент получают при культивировании определенных видов дрожжей, микроскопических грибов (Kluyveromyces lactis, Saccharomyces fragilis, Alternaria tenus и др.) и бактерий (Е. coli, Str. thermophilus и др.).

Фермент применяют при  выработке гидролизованного молока, а также молочной сыворотки, используемой в пищевой промышленности (хлебобулочной, кондитерской). В настоящее время во всех странах находит широкое применение способ получения низколактозного питьевого молока, кефира, йогурта и других продуктов для детей и взрослых людей, организм которых недостаточно усваивает лактозу. В РФ для этой цели используют препарат «Максилакт» (производитель Нидерланды), представляющий собой дрожжевую лактазу, полученную из натуральных молочнокислых дрожжей Kluyveromyces. Гидролиз лактозы молока осуществляют при рН 6,3-6,7 и температуре 35-40°С (но препарат может работать при температуре 4-6°С).

Амилазы. В нормальном молоке содержится в основном α-амилаза, β-амилаза обнаружена в молоке лишь отдельных животных.

Фермент катализирует расщепление  полисахаридных цепей крахмала, гликогена, полисахаридов. Активность α-амилазы в молоке сравнительно высокая и ее количество повышается при заболевании животных. Фермент связан с лактоглобулиновой фракцией молока, имеет оптимум действия при рН 7,4 и температуре 37°С, инактивируется при всех видах пастеризации.

Лизоцим (мурамидаза). Лизоцим катализирует гидролиз 1,4-β-связей между остатками N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина в полисахаридах клеточных стенок некоторых видов бактерий, в первую очередь грамположительных (патогенные стафилококки, стрептококки и другие возбудители мастита коров). Наряду с другими антибактериальными факторами лизоцим в небольшой степени обусловливает бактерицидные свойства молока. Коровье молоко содержит небольшое количество лизоцима — в среднем 13 мкг в 100 см³, женское молоко содержит 10-100 мг в 100 см³.