Липаза коровьего молока: строение, функции

 

 

 

 

 

 

 

1.2.3 Методы определения активности липазы молока.

Для определения активности липаз молока использовались многие методы, в настоящее время наиболее широкое признание получили следующие. Для быстрого скрининга в коммерческих целях пользуются следующим методом. Молочный жир получают с помощью разделения детергентами в молочных бутылках, затем проводят титрование спиртовым раствором едкого калия в присутствии фенолфталеина до появления окраски. Кислоты с короткой цепью, которые в воде полностью или частично растворяются, по-видимому, нельзя обнаружить этим методом. Если использовать силикагель и экстракцию можно обнаружить все свободные кислоты, в том числе масляную. Конец титрования легче обнаружить при работе с тимоловым синим, чем с феноловым красным. Метод с использованием силикагеля является более дорогим и требует больше времени, чем метод титрования щелочью, но незаменим в исследовательских работах, так как дает возможность определить все свободные жирные кислоты количественно. Результаты, полученные указанными методами, выражают в значениях степени кислотности, т. е. в выраженном в молях количестве свободных жирных кислот на 100 г жира [1].

 

1.2.4 Строение и свойства липазы.

Для препарата липазы, полученного  американскими учеными, определен аминокислотный состав. Установлено, что он отличается от аминокислотного состава большинства белков молока, панкреатической липазы свиньи и крысы. Липаза содержала 0,6% опаловой кислоты. Возможно, что сиаловая кислота представляет собой неотъемлемую часть липазы молока [1].

Рисунок 5. Активный центр  и регуляторный участок на поверхности  белковой глобулы.

Получены некоторые сведения и об активных центрах липаз молока. Парахлормеркурибензоат и N-этилмалеимид частично подавляют активность липазы молока. Это указывает на то, что свободные сульфгидрилыные группы локализованы вблизи активного центра, но не участвуют в каталитическом действии, как у панкреатической липазы. Нужно отметить, однако, что одна из липаз молока полностью инактивировалась парахлормеркурибензоатом.

Диизопропилфторфосфат ингибирует липазу молока; диизопропилфторфоофат  в концентрации 1*10^-3 М и диэтил-n-нитрофенил в концентрации 5*10^-4 М полностью блокируют действие фермента. Динитрофторбензол также ингибирует липазу молока; кроме того, фермент быстро инактивируется при фотоокислении. Эти данные указывают на принадлежность липазы молока к ферментам «серин-гистидинового» типа. Активный центр липазы молока стерически более доступен, чем активный центр панкреатической липазы, поскольку в первом случае возможна реакция с диизопропилфторфосфатом, а во втором — нет.

 

1.2.5 Специфичность липазы

Специфичность действия липазы определяется положением эфирных связей в триацилглицероле. Фермент активен по отношению к гидролизу внешних эфирных связей в α(1)- и α'(3)-положениях, в результате чего образуется β(2)-моноацилглицерол. Гидролиз эфирной связи в β-положении 2-моноацилглицерола идет уже более медленно и преимущественно катализируется липазой, секретируемой железами тонкого кишечника, либо после изомеризации β(2)-моноацилглицерола при действии панкреатической изомеразы в α(1)-моноацилглицерол, панкреатическая липаза полностью завершает гидролиз триацилглицерола до конечных продуктов — глицерола и жирной кислоты [6]:

 

 

 

 

1.2.6 Факторы, влияющие на активность липазы молока.

Как и большинство гидролаз эфиров глицерина, липаза молока имеет  оптимум рН 8—9 и температурный  оптимум 35—40 °С. Если допустить, что  механизм ферментативного действия липазы молока сходен с таковым панкреатической  липазы, то кальций в этом случае не требуется. Данные о наличии серина в активном центре также указывают на то, что липаза молока не является металлоферментом. Тем не менее кальций, вероятно, необходим для липолитической реакции, поскольку он предотвращает связывание высших жирных кислот с поверхностью раздела, ведущее к ингибированию липолиза. Ионы натрия играют роль противоионов на поверхности раздела.

Большое влияние на процессе переваривания жиров оказывает желчь, содержащая соли желчных кислот. Желчные кислоты взаимодействуют с жирами и маслами с образованием чрезвычайно тонкой эмульсии, диаметр частиц которой не превышает 0,5 мк. Эмульгирование жира приводит к значительному увеличению поверхности соприкосновения жира с водным раствором липазы и и повышению скорости ферментативного гидролиза жира. Соли желчных кислот кроме того, активируют малоактивную липазу поджелудочной железы.

Активность липазы ингибируется при действии кислорода, света, нагревания, N-этилмалеимида, n-хлормеркурибензоата, иодацетата, перекиси водорода, некоторых антибиотиков, диизопропилфторфосфата и 2,4-динитрофторбензола. Глутатион стабилизирует липазу. Ученые обнаружили, что ингибиторы практически не влияли на состав жирных кислот, высвобождаемых липазой из жира молока. Гомогенизация и вспенивание сырого молока усиливают активность липазы: гомогенизация, возможно, за счет разрушения (мембран жировых глобул молока или освобождения липазы из комплекса с казеином, а вспенивание— за счет увеличения (поверхности жировых глобул и адсорбции на них казеина.

Отмечается  уменьшение активности липазы при добавлении к молоку лецитина или фосфатидилэтаноламина. Эти полярные вещества локализуются на поверхности раздела жировая глобула—сыворотка молока и ингибируют липолиз, вытесняя субстрат с поверхности раздела. Поскольку указанные вещества быстро окисляются, продукты окисления могут оказывать ингибирующее действие. Такое действие было обнаружено в опытах с панкреатической липазой и липазой Geotrichum candidum [1].

 

1.2.7 Переваривание  и всасывание липидов в желудочно-кишечный  тракт

Основная масса липидов  пищи представлена ацилглицеролами, гидролиз которых катализируется липазами. Гидролиз триацилглицеролов происходит у  высших животных и человека преимущественно  в тонком кишечнике при действии панкреатической липазы и липазы тонкого кишечника (рисунок 4).

Рисунок 4. Метаболические превращения  липидов пищи [6]

 

В желудке взрослых людей  имеется желудочная липаза, но она  практически неактивна при низких значениях pH желудочного сока и отсутствии условий для эмульгирования жира. Однако лингвальная липаза, или липаза языка, которая секретируется железами задней части языка, может сохранять активность в кислой среде (рН оптимум 4,0-4,5)  и играет важную роль в пищеварении у грудных детей, и она способна активно гидролизовать эмульгированные жиры молока.

Все липолитические ферменты являются глобулярными, водорастворимыми белками. Посколько липиды нерастворимы в воде, гидролиз происходит лишь на поверхности раздела между липидами и водной фазой. В связи с этим скорость реакции в значительной степени определяется площадью этой границы раздела и поэтому, чем выше степень эмульгирования жира, чем меньше липидные мицеллы, тем больше величина доступной поверхности.

Основными эмульгаторами  липидов в тонком кишечнике являются желчные кислоты, содержащиеся в  виде натриевых солей в желчи, поступающей в двенадцатиперстную кишку из желчного пузыря. В желчи  содержится ряд различных желчных  кислот, которые в печени образуются из холестерола. По химическому строению желчные кислоты являются производными холановой кислоты и отличаются друг от друга чилом и положением гидроксигрупп:

Кроме роли эмульгаторов, желчные  кислоты в кишечнике выполняют  в превращении липидов другие важные функции: способствуют всасыванию продуктов расщепления жиров  и активируют панкреатическую липазу.

Кроме желчных кислот, соли жирных кислот в комплексе с моноацилглицеролами  и ненасыщенными жирными кислотами, будучи поверхностно-активными веществами, также способствуют эмульгированию жира и стабилизации образовавшейся эмульсии.

Панкреатическая липаза (КФ 3.1.1.3) — это гликопротеин с молекулярной массой 48 kDa, секретируется поджелудочной железой в виде неактивного предшественника — пролипазы, имеющего рН-оптимум при 8,0—9,0. В просвете кишечника происходит активация пролипазы путем образования комплекса с низкомолекулярным белком — колипазой (10 kDa) в молярном соотношении 2:1, что способствует сдвигу оптимума рН от 9,0 до 6,0, т. е. до того значения рН в верхнем отделе кишечника, которое бывает обычно после приема пищи. Известно активирующее и стабилизирующее действие желчных кислот на панкреатическую липазу, хотя механизм его остается неясным.

Гидролиз триацилглицеролов идет ступенчато, и только часть 2-моноацилглицеролов (не более 50%) гидролизуется до глицерола и жирных кислот [6].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

II. Экспериментальная часть

Определение активности липазы молока.

Оборудование:

колбы конические на 100 мл (18 шт.); пипетки для прямого слива с одной меткой на 1 и 10 мл; бюретка на 15-20 мл; воронка стеклянная для фильтрования; цилиндр мерный на 50 мл; ступка с пестиком; термостат ни 37^оС; марля.

Материалы и реактивы:

сырое молоко, молоко, прокипяченное  и охлажденное до 17^оС, поджелудочная железа (свежая); желчь; фенолфталеин, 1%-ный раствор; гидроксид натрия, 0,1 н. раствор; липаза лиофилизированная (из поджелудочной  железы свиньи), мезим или фестал.

Ход анализа:

В три конические колбы  на 100 мл налить по 50 мл кипяченого молока, в колбу №1 и №2 (опыт) добавить по 2 мл препарата липазы или по 1 мл раствора лиофилизированной липазы (мезима или фестала), содержащего 1 мг препарата в 1 мл, колбу №3 –  контроль.  В колбу №2 добавить 5-6 капель желчи (для активирования  липазы).

В две другие колбы налить соответственно по 50 мл сырого молока и сырого молока с 5-6 каплями желчи.

Содержимое колб быстро перемешать, сейчас же отобрать пипеткой по 10 мл жидкости и перенести их в 5 других колб на 100 мл (для титрования).

Первые колбы (№1, 2, 3, 4, 5) поставить  в термостат или водяную баню при 37-40°C  на 90 мин.

В колбы для титрования  добавить по 10 мл воды и по 2-3 капли  раствора фенолфталеина. Оттитровать  содержимое каждой колбы 0,1 н. раствором  гидроксида натрия до слабо-розового окрашивания  при непрерывном и тщательном помешивании.

Результаты титрования записать в таблицу.

Через 15, 30. 60 и 90 мин (еще 4 раза) после начала инкубации, отобрать из колб №1, 2, 3, 4, 5 по 10 мл, поместить в  сухие колбы и во все добавить по 10 мл воды и по 2-3 капли раствора фенолфталеина. Оттитровать содержимое каждой колбы 0,1 н. раствором гидроксида натрия до слабо-розового окрашивания  при непрерывном и тщательном помешивании. Данные занести в таблицу.

Для построения графика, показывающего  действие липазы во времени в зависимости  от наличия или отсутствия желчи, по оси абсцисс отложить время, а  по оси ординат – количество свободных  жирных кислот.

 

Таблица 2.1 Количество 0,1н  раствора гидроксида натрия, пошедшего  на титрование молоке коровьего породы черно-пестрая, возраста 5 лет, мл

Время термостатирования, мин	Кипяченое молоко + фермент	Кипяченое молоко + желчь + фермент	Кипяченое молоко (контроль)	Сырое молоко	Сырое молоко + желчь
0	3	3	2,1	2,6	2,3
15	4,2	5,3	2,2	2,7	2,2
30	5,8	7,1	2,2	2,8	2,4
60	6,5	8,9	2,2	2,8	2,5
90	8,3	9,4	2,2	2,8	2,9

 

По данным таблицы 2.1 можно  определить количество выделившихс  жирных кислот по формуле:

где b – количество NaOH, пошедшего на титрование 10 мл молока

m=4% - жирность молока (m=0,4 г) – в 10 мл

5,6 – количество мг  NaOH, соответсвтующее 1 мл 0,1н раствору

k – поправка на титр щелочи

 

До термостатирования:

1)

2)

3)

4)

 

5) 

 

 

После 15 минут термостатирования:

 

 

    1)

 

    2)

 

    3) 

    4) 

    5)       

 

 

 

 

после 30 минут термостатирования:

1)

2)

3)

4)

5)

 

после 60 минут термостатирования

 

1)

2)

3)

 

4)