Пластический метаболизм прокариот: биосинтез пуринов и пиримидинов. Репликация ДНК и РНК

Теперь начинается второй этап синтеза скелета пурина – образование шестичленного кольце. Три из шести атомов этого кольца уже присутст-вуют в рибонуклеотиде аминоимидозола. Три другие атома приходят из СО₂, аспартата и N⁵,N¹⁰–метинилтетрагидрофолята. Следуйщий атом уг-лерода шестичленного кольца вводится путем карбоксилирования рибо-нуклеотида аминоимидазола, приводящим к образованию рибонуклеотида 5-аминоимидазол-4-карбоновой кислоты. Затем аминогруппа аспартата реагирует с карбоксильной группой этого продукта с образованием рибо-нуклеотида 5-аминоимидазол-4-N-сукцинокарбоксамида. На образование этой амидной связи затрачивается молекула АТФ. В следуйщей реакции углеродный скелет аспартата отщепляется в виде фумарата, и образуется рибонуклеотид 5-аминоимидазол-4-карбоксамида. Следует отметить, что в результате этих двух реакций карбоксилат превращается в амид. Таким образом из аспартата в пуриновое кольцо включается только атом азота. Последний атом пуринового кольца происходит из N⁵,N¹⁰–метинилтетра-гидрофолята. В результате образуется рибонуклеотид 5-формилимидазол-4-карбоксиламид; он претерпевает дегидротацию и замыкание кольца, давая инозинат (ИМФ), содержащий полный пуриновый скелет. Пуриновое основание, входяшее в состав инозината, называется гипок-сантин. Схема синтеза пуриновых нуклеотидов представлена на рисунке 1.2.2.

Рисунок 1.2.2 – Схема  синтеза пуринов [14]

 

Инозинмонофосфат является предшественником аденин- и гуанинмо-нофосфатов. Аденилат синтезируется из инозината путем введения амии-ногруппы по С-6 положению вместо карбонильного кислорода. Амино-группу поставляет аспартат путем присоединения этой аминокислоты к рибонуклеотиду и последующего удаления фумарата. ГТФ - донор высо-коэнергетической фосфатной связи при синтезе аденилосукцината из ино-зита и аспартата.

Гуанилат (гуанинмонофосфат) синтезируется путем окисления ино-зината и последующего введения аминогруппы в положение С-2. НАД⁺ - акцептор водорода при окислении инозината до ксантилата. Затем амино-группа боковой цепи глутамина переносится на ксантилат. В этой реакции тратятся две высокоэнергетические связи, так как АТФ расщепляется на АМФ и ФФ_(н), который затем гидролизуется.

Пуриновые основания  могут использоваться повторно с помощью реакций синтеза из готовых остатков с участием ФРПФ. Свободные пури-новые основания образуются путем гидролитического расщепления нук-леиновых кислот и нуклеотидов. Пуриновые нуклеотиды могут синтези-роваться из таких предобразованных оснований с помощью реакций син-теза из готовых остатков. Эти реакции проще чем пути синтеза de novo, и обходятся клетке гораздо дешевле. При синтезе из готовых остатков рибо-зофосфатная группа ФРПФ переносится на пурин и образуется соответ-ствующий нуклеотид – это альтернативный путь синтеза пуриновых нуклеотидов.

Существуют два фермента, участвующие в реакциях синтеза из го-товых остатков, имеющие разную специфичность. Аденинфосфо-рибозил-трансфераза катализирует образование аденилата:

Аденин + ФРПФ → Аденилат + ФФ_(н)

Гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза катализирует образо-вание инозината и гуанилата:

Гипоксантин + ФРПФ →  Инозинат + ФФ_(н)

Гуанин + ФРПФ → Гуанилат + ФФ_(н)  [15]

Ключевой стадией биосинтеза пуринов является образование 5-фос-форибозиламина. Катализирующий эту реакцию фермент глутамин-фос-форибозилпирофосфат—амидотрансфераза ингибируется моно-, ди- и трифосфатами гуанозина и аденозина, что замедляет соответствующие ре-акции основного пути биосинтеза. Так как смесь адениновых и гуани-новых производных ингибирует гораздо сильнее, чем отдельные соедине-ния, то было предположено, что у фермента имеются отдельные участки связывания для адениновых и гуаниновых ингибиторов.

 ГMФ ингибирует образование ХМФ, а AMФ ингибирует синтез аде-нилосукцината из ИMФ. В результате, этот механизм обратной связи пре-дотвращает дальнейшее образование AMФ или ГMФ, когда какой-либо из них присутствует в избыточном количестве. Некоторые регуляторные ста-дии синтеза пуриновых нуклеотидов показаны на рис.1.2.3. [20]

Рисунок 1.2.3 – Регуляция  синтеза пуриновых нуклеотидов

 

1.3. Синтез пиримидинов

В отличие от последовательности реакций синтеза пуриннуклеотидов de novo пиримидиновое кольцо вначале собирается и только затем присо-единяется к рибозофосфату с образованием пиримидиннуклеотида. Доно-ром рибозофосфата при синтезе пиримидиннуклеотидов, так же как и при синтезе пуриннуклеотидов, служит ФРПФ. Предшественники пиримиди-нового кольца - карбамоилфосфат и аспартат (С-2 и N-3 происходят из карбамоилфосфата, остальные атомы кольца - из аспартата) (рис. 1.3.1)

Рисунок 1.3.1 – Источники  атомов углерода и азота для синтеза  пиримидинового кольца

 

Синтез пиримидинов  начинается с образования карбамоилфосфата, который служит также промежуточным продуктом синтеза мочевины. Решающий этап в биосинтезе пиримидинов - образование N-карбамоила-спартата из аспартата и карбамоилфосфата. Карбамоилирование катали-зируется аспартит-транс-карбамоилазой (аспартат-карбамоил-трансфера-зой, АТКазой), ферментом, особенно интересным с точки зрения регуляции. Пиримидиновое кольцо образуется в следующей реакции, когда кар-бамоиласпартат циклизуется с отщеплением молекулы воды и образо-ванием дигидрооротата. Затем при дегидратации дигидрооротата образу-ется оротат.

Следующий этап синтеза  пиримидиннуклеотидов - присоединение рибозофосфатной группы. Оротат (свободный пиримидин) реагирует с ФРПФ с образованием оротидилата (пиримидиннуклеотид). Протекание этой реакции, которую катализирует оротидилат-пирофосфорилаза, поддерживается гидролизом пирофосфата. Затем оротидилат декарбоксилиру-ется, образуя уридилат (уридинмонофосфат, УМФ) - главный пиримидин-нуклеотид. Схема синтеза пиримидиновых нуклеотидов представлена на рисунке 1.3.2 .[15]

Рисунок 1.3.2 – Схема  синтеза пиримидинов

 

 Фактическими предшественниками для синтеза нуклеиновых кислот служат нуклеозидтрифосфаты, которые образуются из нуклеотид моно-фосфатов (НМФ). Таким образом, образование УТФ из УМФ происходит в результате последовательных трансферазных (киназных) реакций при действии нуклеозидмонофосфат- и нуклеозиддифосфаттрансфераз:

УМФ    +     АТФ     ↔     УДФ   +   АДФ

УДФ   +   АТФ   ↔    УТФ   +    АДФ [8].

УМФ далее может использоваться для синтеза других пиримидино-вых мононуклестидов — ЦМФ и dTМФ. Образование ЦМФ протекает через ряд последовательных стадий:

УМФ + АТФ  →  УТФ + АМФ

УТФ + глутамин + АТФ  →  ЦТФ + глутамат + АДФ + Н₃PO₄

ЦТФ + АМФ  →  ЦМФ + АТФ

Как и синтез пуринов, синтез пиримидинов находится под  метабо-лическим контролем, основанным на ингибурующем действии конечных продуктов по типу обратной связи. Регуляторными ферментами являются карбомаилфосфатсинтетаза, аллостерическим ингибитором которой явля-ется УТФ, и аспартаткарбрмаилтрансфераза, которая ингубируется ЦТФ (рис. 1.3.3).

Рисунок 1.3.3 – Регуляция  синтеза пиримидинов

 

Следует отметить, что тип и специфичность контроля обнаруживают интересные вариации в зависимости от вида: аспартаткарбомаилтрансфе-разы из Е.coli, Aerobacter aerogenes и Serratia marcescens ингибируются по принципу обратной связи в присутствии ЦТФ, тогда как фермент из Pseudomonas fluorescens сильнее всего реагирует на УТФ. Далее аспартат-карбомаилтрансфераза из Bacillus subtilis, по-видимому, не ингибируется по аллостерическому типу, а репрессируется её синтез по принципу обрат-ной связи. Эти данные, безусловно, свидетельствуют о многообразии и видовой специфичности регуляторных механизмов клетки, определяющих скорость биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов.

Аналогично пуриновым нуклеотидам  пиримидиновые нуклеотиды также могут образовываться из свободных пиримидинов или нуклеозидов по запасным метаболическим путям. Урацил (и 5-фторурацил) могут быть превращены в УМФ и 5-F-УМФ прямой реакцией с ФРПФ, катализи-руемой урацил-фосфорибозилтрансферазой, которая имеется в клетках как животных, так и микробов. Цитозин не является субстратом  для этого фермента.

урацил   +   ФРПФ   ↔  уридин-5'-фосфат   +   ФФ_н

УМФ может образовываться также из уридина с помощью уриди-цитидинкиназы:

                                                 Mg²⁺

уридин  +  АТФ     →   уридин-5-фосфат   +   АДФ

В этой реакции субстратами могут служить уридин, цитидин и соответствующие фторпроизводные, но не оротидин. Наконец, уридин мо-жет синтезироваться из урацила с помощью реакции, катализируемой ури-динфосфорилазой, которая в обратном направлении приводит к фосфоро-лизу уридина.

урацил   +   рибозо-1-фосфат   ↔   уридин   +   Ф_н

Фосфоролитическое расщепление  цитидина неизвестно; однако после дезаминирования цитидиндезаминазой образовавшийся уридин является субстратом для фосфорилазы.

1.4. Образование дезоксирибонуклеотидов

Пуриновые и пиримидиновые  дезоксирибонуклеотиды образуются в результате восстановления рибозного остатка соответствующего рибонук-леотида. Превращение рибозы в дезоксирибозу идет без расщепления свя-зи рибозы с пиримидином.

Механизм этого превращения был выяснен сначала при изучении восстановления рибонуклеотидов в экстрактах Е. coli. Один фермент — рибонуклеозид-дифосфат-редуктаза — катализирует восстановление всех четырех рибонуклеозиддифосфатов AДФ, ГДФ, ЦДФ и УДФ в их дезокси-производные dAДФ, dГДФ, dЦДФ и dУДФ соответственно. Механизм восстановления включает атаку гидрид-ионом Н^- по атому С-2' рибозного остатка, что приводит к замещению гидроксильной группы у С-2’ на атом водорода без изменения конфигурации.

Источник восстанавливающей  способности рибонуклеозид-редуктазы in vivo неизвестен. Однако было показано, что in vitro активны два донора водорода. Одним является маленький серосодержащий белок тиоредок-син, вторым - восстановленный глутатион, который работает в присутст-вии нового белка — глутаредоксина.

dУМФ, непосредственный предшественник dТМФ, образуется при гидролизе УТФ, катализируемом дезоксиуридинтрифосфатдифосфогидро-лазой (dУТФазой):

дезоксиуридин-5'-трифосфат + Н₂0 → дезоксиуридин-5'-фосфат + ФФ_н

Эта реакция служит также для предотвращения включения урацила в ДНК (рис. 1.3.4).

Рисунок 1.3.4 – Общая  схема взаимопревращений пиримидиновых  дезоксирибонуклеотидов

 

Активность рибонуклеозид-дифосфат-редуктазы  аллостерически ре-гулируется нуклеозидтрифосфатами, одни из них работают как стиму-ляторы, другие - как ингибиторы. Так, восстановление ЦДФ и УДФ силь-но стимулируется АТФ, а восстановление AДФ и ГДФ стимулируют dГТФ и dTTФ. dATФ ингибирует восстановление всех четырех рибонук-леозиддифосфатов. В присутствии Са²⁺, Мg²⁺ или Мn²⁺ dЦТФ является аллостерическим активатором этого фермента, а dТТФ — ингибитором. Метилирование dУМФ катализируется тимидилатсинтетазой.

Общая система эффекторов и ингибиторов делает возможным  сбалан-сированное поступление восстановленных дифосфатов и, следовательно, трифосфатов, непосредственных предшественников синтеза ДНК. [20]

 

2. ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВАЯ  КИСЛОТА 

 

Вся информация о признаках, присущих организму, сосредоточена в его генетическом аппарате. Он обеспечивает сохранение и воспроизве-дение этих признаков в процессе размножения организма, так как возник-ающие дочерние особи обнаруживают в большинстве случаев полное сходство с родительскими формами. Это говорит о том, что генетический аппарат обладает высокой стабильностью и точностью механизмов, обес-печивающих его функционирование. Однако стабильность генетического аппарата не абсолютна, так как это исключало бы всякую возможность его изменений и, следовательно, эволюционных преобразований, приведших в конечном итоге к возникновению разнообразных форм жизни, свидете-лями (и представителями) которых мы являемся. Таким образом, генети-ческий аппарат должен быть организован так, чтобы, с одной стороны, обеспечивать свою стабильность, с другой — быть достаточно пластич-ным, т. е. обладать способностью к изменчивости.

2.1. Структура ДНК

 Генетический материал  любой клетки представлен ДНК, информа-ционные свойства которой определяются специфической последователь-ностью четырех нуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Эта последова-тельность и является первичной структурой ДНК [3] .

Как было сказано выше, в состав ДНК входят такие азотистые основания как аденин, гуанин, цитозин и тимин, а также специфические минорные (мо-дифицированные) основания. Такие минорные основания нужны для того чтобы отличить собственную ДНК от чужеродной, так как чужеродная ДНК может стать губительной для клетки хозяина. Преобразование стандартного основания на минорное происходит с помощью специальных модифициру-ющих ферментов. Практически все виды бактерий имеют метилазы, модифи-цирующие аденин или цитозин в определенной, характерной для данного вида последовательности ДНК. Другой специальный фермент, эндонуклеаза рестрикции (рестриктаза), узнает ту же последовательность и разрезает ее, если она не модифицирована, т. е. попала в клетку извне. Таким путем бакте-рии ограничивают возможности попадания в них постороннего генетическо-го материала. Некоторые ферменты рестрикции представлены в таблице 2.1.1

Таблица 2.1.1 – Ферменты рестрикции

Фермент рестрикции	Сайт узнавания	Источник
Bst I	5’ – GGATC*C – 3’       CC*TAGG	Bacillus stearothermophilus
Hind III	5’ – A*AGCTT – 3’       TTCGAA*	Haerophilus influenzae Rd
Alu I	5’ – AGC*T – 3’         TC*GA	Arthrobacter luteus
Pst I	5’ – CTGCA*G – 3’       GA*CGTC	Providencia stuartii