Пластический метаболизм прокариот: биосинтез пуринов и пиримидинов. Репликация ДНК и РНК

Нативные ДНК двуспиральны; следовательно, перед репликацией  це-пи родительской молекулы, матричные цепи ДНК, должны быть разделе-ны. Эту реакцию осуществляют два типа белков: хеликазы и SSB-белки. Хеликазами называют ДНК-зависимые АТФ-азы, использующие энергию гидролиза АТФ для расплетания двойной спирали ДНК. Считается, что хеликаза, движимая гидролизом АТФ, однонаправленно «едет» по одной из цепей ДНК, расплетая перед собой двойную спираль. Есть хеликазы, которые едут от 5'-конца к 3'-концу цепи ДНК, и есть другие, перемеща-ющиеся в обратном направлении. В результате работы хеликаз возникает «вилка» из двуспирального участка ДНК и двух одноцепочечных ветвей. Ренатурации одноцепочечных участков ДНК препятствует их связывание SSB-белком, имеющим избирательное сродство к однонитевой ДНК (рис. 2.4.2). Роль SSB-белка в репликации, по-видимому, состоит в том, чтобы расправить ДНК, вытянуть ее и удалить возможные элементы вторичной структуры, которые могли бы образоваться в самокомплементарных учас-тках ДНК. Связывание одноцепочечной ДНК с SSB-белком стимулирует ДНК-полимеразу и повышает точность ее работы. SSB-белок Е. coli — тетрамер, состоящий из идентичных субъединиц размером 19 кД. SSB-белок связывается с ДНК кооперативно, т. е. за счет белок-белковых взаи-модействий тетрамеры покрывают ДНК вплотную друг к другу. [1]

Рисунок 2.4.2 – Расплетение  двойной спирали ДНК хеликазой  и SSB-белком

Так как цепи ДНК в дуплексе антипараллельны, то очевидно, что на-правление расплетания двойной спирали при репликации совпадает с на-правлением синтеза ДНК лишь для одной матричной цепи, но противопо-ложно направлению синтеза ДНК на комплементарной матрице. Это зна-чит, что лишь на одной из матричных цепей синтез ДНК может проис-ходить непрерывно. Показано, что ДНК синтезируется сравнительно ко-роткими фрагментами, называемыми фрагментами Оказаки. Таким обра-зом, синтез ДНК на двух матричных цепях исходной молекулы заметно различается. Новосинтезированная цепь, которая синтезируется непрерыв-но, называется ведущей, другая цепь называется запаздывающей. Каждый фрагмент оказаки имеет на 5'-конце несколько рибонук-леотидов — ре-зультат действия праймазы. Фрагменты сшиваются в одну ковалентноне-прерывную цепь ДНК предназначенным специально для этого ферментом, ДНК-лигазой.

ДНК-лигазы обнаружены у  самых разных организмов. Они нуждаются в высокоэнергетических кофакторах: например, лигаза Е. coli нуж-дается в NAD⁺, а широко используемая для генно-инженерных методик лигаза фага Т4 — в АТФ. Прежде чем образовать фосфодиэфирную связь, соединяющую два фрагмента ДНК, лигаза активирует 5'-конец одного из фрагментов с помощью высокоэнергетического кофактора 3. [9]

2.5. Различия в ДНК прокариот и эукариот

Геном бактерий практически  целиком состоит из генов (с их индиви-дуальной последовательностью оснований) и примыкающих к ним регуля-торных элементов. Почти все природные ДНК состоят из двух цепей (иск-лючение составляют одноцепочечные ДНК некоторых вирусов). При этом ДНК может иметь линейную форму (ДНК эукариот) или кольцевую (ДНК прокариот). У эукариот кольцевая ДНК может входить в состав митохон-дрий и хлоропластов. ДНК этих органелл называют цитоплазматической; она составляет примерно 0,1% всей клеточной ДНК.

 В клетках прокариот ДНК организована в одну хромосому (нукле-оид) и представлена одной кольцевой макромолекулой. Нуклеоид, в отли-чии от ядра эукариот, не отделен от цитоплазмы ядерной мембраной, в нем может содержаться несколько копий ДНК. Плотность генов в геноме прокариот значительно выше, чем в геноме эукариот. В отличие от боль-шинства эукариотических генов гены прокариот не прерываются некоди-руюшими областями, т.е. не имеют мозаичной экзон-интронной струк-туры.

Кроме того, в клетках  некоторых бактерий имеется одна или не-сколько плазмид. У эукариот основная масса ДНК находится в ядре клет-ки в составе хромосом (ядерная ДНК). В каждой хромосоме эукариот име-ется только одна линейная молекула ДНК, но так как во всех клетках эука-риот (кроме половых) присутствует двойной набор гомологичных хромо-сом, то и ДНК представлена двумя неидентичными копиями, получен-ными организмом от отца и матери при слиянии половых клеток.

Молекулярная масса  эукариотических ДНК выше, чем  у ДНК прокариот. Размеры молекул ДНК обычно выражаются числом образу-ющих их нуклеотидов. Эти размеры варьирует от нескольких тысяч пар нуклеотидов у бактериальных плазмид и некоторых вирусов до многих сотен тысяч пар нуклеотидов у высших организмов. [21]

Таким образом ясно, что  наследственная информация записана в ли-нейной последовательности нуклеотидов. У разных организмов она строго индивидуальна и служит важнейшей характеристикой, отличающей одну молекулу ДНК от другой и, соответственно, один ген от другого. Организ-мы разных видов отличаются друг от друга потому, что молекулы ДНК их клеток имеют разную последовательность нуклеотидов, то есть несут разную информацию.

3. РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА

Молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК) представлены в различных внутриклеточных отсеках, более широко чем ДНК. Они имеют значительно меньшую молекулярную массу. Первичная структура, подобно ДНК, пред-ставлена последовательностью нуклеотидов, однако, азотистое основание ти-мин в РНК заменяет урацил. Состав РНК различных бактерий представлен в приложении А таблице 2. Молекулы РНК, построенные из двух комплемен-тарных полинуклеотидных цепей, встречаются редко и обнаруживаются только в составе некоторых вирусов.

Количественное содержание РНК в клетке значительно варьирует  по мере роста культуры и составляет 86,8 ∙ 10^-15 – 259,4 ∙ 10^-15 г при культиви-ровании в L-бульоне и 95,8 ∙ 10^-15 – 182,3 ∙ 10^-15 г в минеральной среде с пеп-тоном. Максимальное количество РНК в клетке обнаружено в конце лаг-фазы и в начале экспоненциальной фазы – к концу первого деления клеток, затем содержание её снижается и почти не изменяется до конца времени культивирования – до начала стационарной фазы. [12]

3.1. Виды РНК и их  структурная организация

К настоящему времени  удалось определить первичную структуру  большинства тРНК, рРНК, мРНК и выявить основные закономерности их структурной организации.

Структурная организация  мРНК. мРНК — наиболее гетерогенный в отношении размеров и стабильности класс РНК. Содержание мРНК в клетках составляет 2—6% от тотального количества РНК. мРНК, обладают некото-рыми специфическими структурными особенностями. мРНК состоят из учас-тков — цистронов, определяющих последовательность аминокислот в кодируемых ими белках, и нетранслируемых областей на концах молекулы. Для цистронных областей характерна уникальная последовательность нук-леотидов, определяемая нуклеотидной последовательностью гена, нетранс-лируемые области имеют некоторые общие закономерности нуклеотидного состава строения. Дальше следует прецистронный нетранслируемый участок, в котором (от 3-15 нуклеотидов до инициирующего кодона) располагается последовательность нуклеотидов, комплементарная последовательность рРНК. Ее роль — обеспечение правильного вза-имодействия 5'-конца с рибо-сомой. Завершается цистрон терминирующим кодоном, за которым следует постцистронный нетранслируемый участок, имеющий в своем составе харак-терный для многих видов гексануклеотид ААУААА. У большинства мРНК 3'-конец содержит полиаденилатную цепочку из 20—250 адениловых нуклео-тидов, не являющуюся результатом транскрипции, а присоединяющуюся к мРНК в ходе созревания ферментативным путем. Предполагается, что поли-аденилатная последовательность отвечает за поддержание внутриклеточной стабильности мРНК, определяет ее время существования.

мРНК обладают сложной  вторичной структурой, обеспечивающей вы-полнение ими матричной функции в ходе трансляции. Показано, что в целом в линейной молекуле мРНК формируется несколько двухспиральных шпи-лек, на концах которых располагаются «знаки» инициации и терминации трансляции.

Структурная организация  тРНК. Транспортные РНК выполняют функции посредников (адаптеров) в ходе трансляции мРНК. Каждой из 20 протеиногенных аминокислот соответствует своя тРНК. Для некоторых аминокислот, кодируемых двумя и более кодонами, существуют несколько тРНК.

тРНК представляют собой  сравнительно небольшие одноцепочечные молекулы, состоящие из 70—93 нуклеотидов. Их молекулярная масса состав-ляет (2,4—3,1) • 10⁴кД. На долю тРНК приходится примерно 15% суммарной клеточной РНК.

К настоящему времени  установлена нуклеотидная последовательность почти для 300 тРНК, выделенных из разных видов организмов и обладающих разной аминокислотной специфичностью. Несмотря на различия в нукле-отидной последовательности, все тРНК имеют много общих черт. Во всех тРНК восемь или более нуклеотидов содержат различные минорные основа-ния. Обязательными минорными компонентами для всех тРНК являются ди-гидроуридин и псевдоуридин. В большинстве тРНК на 5'-конце находится остаток гуаниловой кислоты, а на 3'-конце всех тРНК, называемом акцепторным, обязательным является тринуклеотид - ЦЦА (3').

Вторичная структура  тРНК формируется за счет образования макси-мального числа водородных связей между внутримолекулярными компле-ментарными парами азотистых оснований. В результате образования этих связей поли нуклеотидная цепь тРНК закручивается с образованием спирали-зованных ветвей, заканчивающихся петлями из неспаренных нуклеотидов. Пространственное изображение вторичных структур всех тРНК имеет форму клеверного листа (рис. 3.1.1).

Рисунок 3.1.1 – Вторичная  структура тРНК

В «клеверном листе» различают  четыре обязательные ветви, более длинные тРНК, кроме того, содержат короткую пятую (дополнительную) ветвь.

Адапторную функцию  тРНК обеспечивают акцепторная ветвь, к 3'-концу которой присоединяется эфирной связью аминокислотный остаток, и противостоящая акцепторной ветви антикодоновая ветвь, на вершине кото-рой находится петля, содержащая антикодон. Антикодон представляет собой специфический триплет нуклеотидов, который комплементарен в антипараллельном направлении кодону мРНК, кодирующему соответствующую аминокислоту.

Т-Ветвь, несущая петлю псевдоуридина, обеспечивает взаимодействие тРНК с рибосомами. Д-ветвь, несущая дегидроуридиновую петлю, вероятнее всего обеспечивает взаимодействие тРНК с соответствующей аминоацил-тРНК-синтетазой. Функции пятой дополнительной ветви пока мало исследованы, вероятнее всего она уравнивает длину разных молекул тРНК.

Третичная структура  тРНК очень компактна и образуется путем сближения отдельных ветвей клеверного листа за счет дополнительных водородных связей и стэкинг-взаимодействий. При этом акцепторное плечо, связыва-ющее аминокислоту, оказывается расположенным на одном конце молекулы, а антикодон — на другом.

Структура рибосомных РНК и рибосом. Рибосомные РНК формируют ту основу, с которой связываются специфические белки при образовании рибосом. Рибосомы — это нуклеопротеиновые органеллы, обеспечивающие синтез белка на мРНК-матрице. Исследования последних лет показали, что рибосомные РНК являются не только структурными компонентами рибосом, но и обеспечивают правильное связывание их с определенной нуклеотидной последовательностью мРНК, устанавливая тем самым начало и рамку считы-вания при образовании полипептидной цепи. Кроме того рРНК участвуют в обеспечении взаимодействия рибосом с тРНК.

В рибосомах имеются  две бороздки, одна из них удерживает мРНК, другая — растущую полипептидную цепь. Помимо этого, в рибосомах имеются два участка, связывающих тРНК-аминоацильный (А-участок) и пептидиль-ный (П-участок). Образование и функционирование А- и П-участков обеспечивается обеими субчастицами рибосом. [8]

3.2. Транскрипция 

Транскрипция является первой стадией реализации (считывания) генетической информации, на которой нуклеотидная последовательность ДНК копируется в виде нуклеотидной последовательности РНК. В основе механизма копирования при транскрипции лежит тот же структурный принцип комплементарного спаривания оснований, что и при репликации. Транскрипция осуществляется ферментами РНК-полимеразами, синтезирую-щими РНК на ДНК-матрице из рибонуклеозидтрифосфатов.

В клетках бактерий имеется  только один тип РНК-полимеразы, осуществляющий матричный синтез всех видов РНК. Это крупный белок с молекулярной массой около 500000 Д, имеющий сложную субединичную структуру. Его ядро (core), которое также называется минимальным ферментом, построено из четырех полипептидов: двух идентичных α-субъединиц, β- и β’-субъединиц. Полная РНК-полимераза содержит еще одну субъединицу, которую называют σ-фактором. [5]

Синтез молекул РНК  начинается в определенных местах ДНК, называемых промоторами, и завершается в терминаторах (рис. 3.2.1). Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции — оперон. В пределах каждого оперона копи-руется только одна из двух нитей ДНК, которая называется значащей или матричной. Во всех оперонах, считываемых в одном направлении, значащей является одна нить ДНК; в оперонах, считываемых в противоположном направлении, значащей является другая нить ДНК.

Рисунок 3.2.1 – Цикл транскрипции

Цикл транскрипции можно разделить на четыре основные стадии, каждая из которых в свою очередь состоит из многих элементарных этапов:  связывание с ДНК, инициация цепи РНК, рост (элонгация) цепи РНК, терминация цепи РНК.