Пластический метаболизм прокариот: биосинтез пуринов и пиримидинов. Репликация ДНК и РНК

Нуклеоид достаточно четко выявляется в световом микроскопе после специфической  окраски на ДНК по методу Фёльгена или при окраске флу-орохромами. Его можно наблюдать и с помощью фазово-контрастного устройства у крупных бактерий или сине-зеленых водорослей, как темное и более контрастное образование в срединной части клетки. На ультра-тонких срезах зона нуклеоида представлена тонкими рыхлыми сетями фибрилл толщиной 2-7 нм. Эта зона нуклеоида или нуклеоплазмы на ульт-ратонких срезах свободна от других структур и выглядит более светлой по сравнению с окружающей цитоплазмой, заполненной рибосомами, раз-личными гранулами и мембранами. Иногда на срезах можно наблюдать контакты фибрилл нуклеоида с плазматической мембраной, с ее выроста-ми.

Нуклеоиды бактерий можно выделить, их состав и структура изучены довольно подробно, они на 80% состоят из ДНК, кроме которой обнару-живаются различные белки (20%) и РНК. [22]

Внехромосомная ДНК представлена плазмидами, инсерционными фрагментами (IS-фрагментами), транспозонами. Для плазмид характер-но стабильное существование в нехромосомном состоянии. Транспозоны и IS-элементы входят, как правило, в состав хромосом, но способны пере-ходить из хромосомы в плазмиду, поэтому также могут быть отнесены к нехромосомным генетическим элементам.

Изучение нехромосомных  генетических элементов обнаружило, что общий объем ДНК, входящий в их состав, превышает объем генома каждой особи. Таким образом, у прокариот большой объем генетической информации оказывается рассредоточенным в нехромосомных элементах. Это заставляет по-новому подходить к вопросу об организации генети-ческой информации в мире прокариот. Особенностью генетической ин-формации, содержащейся в нехромосомных элементах, является ее необя-зательность для жизнедеятельности бактерий, т. е. в ее отсутствие бакте-риальная клетка жизнеспособна, новажная роль нехромосомных генети-ческих элементов заключается в том, что они расширяют возможности су-ществования бактериального вида, обеспечивают обмен генетическим ма-териалом на большие расстояния по горизонтали и играют определенную роль в эволюции прокариот.

Плазмиды обнаружены у многих бактерий, принадлежащих к разным таксономическим группам. Количество плазмидной ДНК в клетке состав-ляет обычно не более нескольких процентов от клеточного генома, а чис-ло плазмид колеблется от 1 до 38. Плазмиды — это линейные или коль-цевые ковалентно замкнутые молекулы ДНК, содержащие от 1500 до 40000 пар нуклеотидов. Большинство плазмид состоит из трех групп ге-нов: участка ДНК, ответственного за автономную репликацию плазмиды в клетке; системы генов, обеспечивающих возможность переноса плазмид из одной клетки в другую; генов, определяющих свойства, полезные для клетки-хозяина.

Иногда плазмиды могут  встраиваться в главную молекулу ДНК и на-ходиться в ней, как ее часть, подобно любой другой последовательности. Встроенные плазмиды называют эписомами. Эписома может также вы-щепляться из главной молекулы ДНК и опять становиться свободной плазмидой.

Обычно о присутствии  плазмид в бактериальной клетке судят по про-явлению определенных признаков, к которым относится устойчивость к отдельным лекарственным препаратам, способность к переносу генов при конъюгации, синтез веществ антибиотической природы, способность ис-пользовать некоторые сахара или обеспечивать деградацию ряда веществ. Из перечисленного выше видно, что плазмиды делают возможным сущес-твование организмов в более широком диапазоне условий внешней среды, т.е. действуют как факторы адаптации. [3]

В соответствии с определёнными  признаками, кодируемыми плаз-мидными генами, выделяют следующие группы плазмид:

∙ F-плазмиды. При изучении процесса скрещивания бактерий оказалось, что способность клетки быть донором генетического материала связана с присутствием особого F-фактора. F-плазмиды контролируют синтез F-пи-лей.

∙ R-плазмиды кодируют устойчивость к лекарственным препаратам (на-пример, к антибиотикам и сульфаниламидам, хотя некоторые детерминанты устойчивости правильнее рассматривать как связанные с транспо-зонами), а также к тяжёлым металлам. R-плазмиды включают все гены, ответственные за перенос факторов устойчивости из клетки в клетку.

Неконъюгативные плазмиды обычно характерны для грамположи-тельных кокков, но встречаются также у некоторых грамотрицательных микробов (например, у Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae). Они обычно имеют небольшие размеры. Обнаруживают большое количество мелких плазмид (более 30 на клетку), так как только наличие такого коли-чества обеспечивает их распределение в потомстве при клеточном деле-нии. При конъюгации донор может передать и неконъюгативные плазми-ды за счёт связывания генетического материала последних с конъюгатив-ной плазмидой.

Плазмиды биодеградации. Обнаружен также ряд плазмид, кодиру-ющих ферменты деградации природных (мочевина, углеводы) и непри-родных (толуол, камфора, нафталин) соединений, необходимых для ис-пользования в качестве источников углерода или энергии, что обеспечива-ет им селективные преимущества перед другими бактериями данного ви-да. Патогенным бактериям подобные плазмиды придают преимущества перед представителями аутомикрофлоры.

Вставочные (инсерционные) последовательности — простейший тип мигрирующих элементов (рис. 2.3.1, А); их величина не превышает 1500 пар оснований (в среднем 800-1400). IS-элементы самостоятельно не реплицируются и не кодируют распознаваемых фенотипических приз-наков. Содержащиеся в них гены обеспечивают только их перемещение из одного участка в другой. Основные функции IS-последовательностей — регуляция активности генов бактериальной клетки (могут инактивировать гены, в которые включились, или, встраиваясь в хромосому, проявлять эф-фект промотора, включающего либо выключающего транскрипцию соот-ветствующих генов), координация взаимодействий ппазмид, траспозонов и профагов (как между собой, так и бактериальной хромосомой).

Рисунок 2.3.1 – Инсерционная последовательность (А), транспозон (Б)

Транспозоны состоят из 2000-25000 пар нуклеотидов, содержат фраг-мент ДНК, несущий специфические гены, и два концевых IS-элемента (рис. 2.3.1, Б). Транспозоны не способны к самостоятельной репликации и размножаются только в составе бактериальной хромосомы. Каждый тран-спозон обычно содержит гены, привносящие важные для бактерии харак-теристики типа множественной устойчивости к антибактериальным аген-там. Поскольку транспозоны содержат гены, определяющие фенотипичес-ки выраженные признаки (например, устойчивость к антибиотикам), то их легче обнаружить, чем IS-элементы. В общем, для транспозонов характер-ны те же гены, что и для плазмид (гены устойчивости к антибиотикам, токсинообразования, дополнительных ферментов метаболизма). [13]

2.4. Репликация ДНК

Способность генетического  материала, ДНК, к самовоспроизведению (репликации) лежит в основе размножения живых организмов, передачи наследственных свойств из поколения в поколение.

 Модель ДНК Уотсона  и Крика сразу же позволила понять принцип удвоения ДНК. Поскольку каждая из цепей ДНК содержит последователь-ность нуклеотидов, комплементарную другой цепи, т. е. их информацион-ное содержание идентично, представлялось вполне логичным, что при удвоении ДНК цепи расходятся, а затем каждая цепь служит матрицей, на которой выстраивается комплементарная ей новая цепь ДНК. В резуль-тате образуются два дуплекса ДНК, каждый из которых состоит из одной цепи исходной родительской молекулы ДНК и одной новосинтезиро-ванной цепи. Экспериментально показано, что именно так, по полуконсер-вативному механизму, происходит репликация ДНК. Несмотря на просто-ту основного принципа, процесс репликации сложно организован и тре-бует участия множества белков. Эти белки, как и все другие, закодирова-ны в последовательности нуклеотидов ДНК. Таким образом, возникает важнейшая для жизни петля обратной связи: ДНК направляет синтез бел-ков, которые реплицируют ДНК.

Комплементарное копирование  матрицы осуществляют ферменты ДНК-полимеразы. Первый фермент этого типа был открыт в 1956 г. у Е. coli, затем ДНК-полимеразы были обнаружены в других организмах. ДНК-полимеразы ведут синтез ДНК на одноцепочечной матрице, если имеется затравка — комплементарный матрице фрагмент растущей цепи ДНК. ДНК-полимеразы последовательно наращивают конец затравки, шаг за шагом присоединяя к нему следующие нуклеотиды, причем выбор очередного нуклеотида для присоединения к концу затравки диктуется матрицей.

Субстрат для ДНК-полимеразы,   поступает в реакцию в активиро-ванной высокоэнергетической форме дезоксирибонуклеозидтрифосфата. Присоединение очередного нуклеотида к концу затравки сопровождается гидролизом богатой энергией связи и отщеплением пирофосфата, что и делает реакцию в целом энергетически выгодной. Наличие в клетке пиро-фосфатазы обеспечивает расщепление пирофосфата и делает реакцию практически необратимой. При полимеризации растет всегда 3'-конец затравки, т. е. синтез происходит в направлении 5'→3': 3'-ОН-группа кон-цевого нуклеотида затравки атакует фосфат очередного дезоксирибонук-леозидтрифосфата (но только в том случае, если он комплементарен очередному нуклеотиду матрицы), в результате чего отщепляется пирофос-фат, а дезоксирибонуклеозидмонофосфат оказывается связанным фосфо-диэфирной связью с растущей цепью ДНК, удлиняя ее на одно звено.

Затравка антипараллельна матрице (рис. 2.4.1). Естественно, эта по-лярность сохраняется и при ее дальнейшем росте, так что результатом ра-боты ДНК-полимеразы на одноцепочечной матрице является антипарал-лельная двойная спираль ДНК.

Рисунок 2.4.1 – Матричный синтез ДНК

 Необходимая для полимеризации геометрия химических группировок в активном центре ДНК-полимераз задается с помощью координа-ционного взаимодействия определенных атомов матрицы, затравки и суб-страта с ионами металлов. Субстраты поступают в реакцию синтеза ДНК в виде комплексов (хелатов) с ионами Мg²⁺. Ионы обеспечивают правильную взаимную ориентацию 3'-ОН-группы затравки, фосфата субстрата и очередного нуклеотида матрицы. Показано, что ионы цинка способны и без ферментов в ограниченной степени катализировать образование комплементарных матрице олигонуклеотидов из активированных субст-ратов.

Нормальное размножение  клеток требует высокой точности копирования ДНК-матрицы. У всех организмов точность работы репликатив-ной машины (включающей не только ДНК-полимеразы, но и другие белки) как раз такова, чтобы обеспечить безошибочное воспроизведение всего генома или допустить лишь малое число ошибок. Так, у бактерий ошибки синтеза ДНК происходят не чаще чем один раз на много мили-онов нуклеотидов. Для того чтобы обеспечить высокую точность наряду с высокой скоростью репликации, природе пришлось прибегнуть к специ-альным механизмам, один из которых — механизм коррекции.

ДНК-полимеразы проверяют комплементарность каждого нуклеотида матрицы дважды: один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь образуется лишь в том случае, если последний (3'-концевой) нуклеотид затравки комплементарен матрице. Если же на пре-дыдущей стадии полимеризации произошла ошибка (например, из-за того, что нуклеотид в момент полимеризации находился в необычной тауто-мерной форме), то репликация останавливается до тех пор, пока непра-вильный нуклеотид не будет удален. Некоторые ДНК-полимеразы обла-дают не только полимеризующей, но и 3'-экзонуклеазной активностью, которая отщепляет не спаренный с матрицей нуклеотид затравки, после чего полимеризация восстанавливается. Этот механизм, коррекция, замет-но увеличивает точность работы ДНК-полимераз.

Иногда один полипептид обладает и полимеразной, и 3'-экзонук-леазной активностями, в других случаях за эти активности ответственны разные субъединицы мультисубъединичного фермента. У некоторых ДНК-полимераз корректирующая экзонуклеазная активность не обнару-жена.

Репликация лучше всего  изучена у Е. coli. У этого организма есть три ДНК-полимеразы (I, II и III). Все три фермента и их аналоги из других бактерий обладают корректирующей способностью.

ДНК-полимераза I состоит из одного полипептида длиной 911 аминокислотных остатков (а. а.) (М_г=102 000 Д). Этот фермент отличается от прочих ДНК-полимераз Е. coli наличием 5'-экзонуклеазной активности. Фактически ДНК-полимераза I — это два фермента на одной полипептид-ной цепи: ограниченный протеолиз расщепляет эту ДНК-полимеразу на большой и малый фрагменты с разными активностями. Большой субфраг-мент ДНК-полимеразы I (называемый также ДНК-полимеразой Кленова или фрагментом Кленова) обладает полимеризующей и 3'-экзонуклеазной (корректирующей) активностями. Малый субфрагмент несет 5'-экзонукле-азную активность. 5'-экзонуклеаза ДНК-полимеразы I действует на 5'-ко-нец полинуклеотидной цепи только в составе дуплекса и отщепляет от него как моно-, так и олигонуклеотиды. Направление действия 5'-экзонук-леазы совпадает с направлением полимеризации новой цепи ДНК, т. е. в ходе полимеризации экзонуклеаза «расчищает дорогу» для полимеразы. Подобные свойства ДНК-полимеразы I соответствуют ее функциям в клетке: эта полимераза удаляет различного рода дефекты из ДНК в ходе репарации и служит вспомогательной полимеразой при репликации ДНК, удаляя РНК-затравки. В клетке Е. coli имеется несколько сотен молекул ДНК-полимеразы I.

ДНК-полимераза II — полипептид с М_г около 120000, обладающий полимеразной и 3'-экзонуклеазной активностями. Эта полимераза лучше всего работает на двуцепочечной ДНК с одноцепочечными брешами в не-сколько десятков нуклеотидов длиной. На этом основании можно предпо-ложить, что ДНК-полимераза II участвует в репарации ДНК. Главную роль в репликации ДНК у Е. coli играет большой мультисубъединичный фермент — ДНК-полимераза III. В клетке всего несколько таких мульти-меров, приблизительно столько же, сколько репликативных вилок. ДНК-полимераза III состоит из 7 типов субъединиц (таблица 2.4.1) и имеет суммарную молекулярную массу около 500 кД.

Таблица 2.4.1 – Компоненты холофермента ДНК-полимеразы III E.coli

Отличительная черта  холофермента ДНК-полимеразы III — исключительно высокая процессивность синтеза ДНК (количество нуклеотидов, присоединяемых ферментом к растущей цепи между двумя последовательными актами диссоциации с матрицы).

ДНК-полимеразы не способны инициировать новые цепи ДНК. Они могут лишь достраивать уже имеющуюся затравку. Это свойство, по-ви-димому, связано с предъявляемым к синтезу ДНК требованием высокой точности. Новосинтезированные цепи ДНК всегда содержат на 5'-конце несколько рибонуклеотидов. Иными словами, синтез ДНК начинается с синтеза РНК. РНК-затравку для синтеза ДНК образует специальный фер-мент, называемый ДНК-праймазой. После того как цепь ДНК начала син-тезироваться, РНК-затравки удаляются и образовавшиеся бреши застраи-ваются ДНК-полимеразой, т. е. с высокой точностью.