Пластический метаболизм прокариот: биосинтез пуринов и пиримидинов. Репликация ДНК и РНК

 

 

Последовательно расположенные  нуклеотиды в молекулах ДНК и РНК ковалентно связаны друг с другом при помощи фосфатных «мос-тиков». 5'-гидроксильная группа пентозы одного нуклеотида присоеди-нена к З'-гидроксильной группе пентозы соседнего нуклеотида с помощью фосфодиэфирной связи (рис.2.1.1). Таким образом, ковалентные остовы нуклеиновых кислот состоят из монотонно чередующихся фосфат-ных и пентозных групп; основания же можно рассматривать как боковые групп-пы, присоединенные к остову на равных расстояниях друг от друга. Структуру одиночной цепи ДНК изображают всегда так, что слева располагается 5'-конец, а справа -  З'-конец, т.е. в направлении 5'→ 3'.

Рисунок 2.1.1 – Первичная  структура ДНК

 

Межнуклеотидные связи  в ДНК и РНК можно химически расщепить с помощью гидролиза. Их можно гидролизовать и ферментами, которые называются нуклеазами. Некоторые нуклеазы способны расщеплять связи между двумя соседними нуклеотидами, расположенными внутри цепи, такие нуклеазы называют эндонуклеазами. Нуклеазы другого класса могут катализировать гидролиз только связи концевого нуклеотида или у 5'- или у 3'-конца молекулы; эти ферменты относятся к экзонуклеазам.

В конце 40-х годов Эрвином Чаргаффом  и его коллегами из Колум-бийского университета велась работа по изучению структуры ДНК. Они обнаружили, что четыре основания встречаются в ДНК разных организ-мов в различных соотношениях и что между основаниями существует оп-ределенная количественная связь. На основе этого были сделаны следую-щие выводы:

1. Нуклеотидный состав ДНК у разных видов различен.

2. Число адениновых остатков в любой ДНК независимо от вида организма равно числу тиминовых остатков (А = Т), а число гуаниновых остатков всегда равно числу цитозиновых остатков (Г = Ц). Из этих соот-ношений следует, что сумма пуриновых остатков равна сумме пиримиди-новых остатков, т.е. А + Г = Т + Ц.

3. В ДНК отношение Г + Ц/А + Т, называемое коэффициентом специфичности, близко к единице. [9]

В ДНК некоторых видов  преобладает суммарное количество аденина и тимина, это так называемые АТ-тип ДНК. ГЦ-тип (с суммарным преоб-ладанием гуанина и цитозина) встречается у микроорганизмов, хотя некоторые из них могут иметь и АТ-тип. Нуклеотидный состав ДНК бак-терий в настоящее время используют как один из таксономических при-знаков. Состав ДНК различных бактерий представлен в приложении А.

Результаты рентгеноструктурного анализа ДНК, опубликованные Вилкинсом, Франклином, свидетельствуют о том, что нуклеотиды ДНК расположены в форме спирали (рис 2.1.2) с периодом идентичности (ша-гом) 3,4 нм и расстоянием между плоскостями оснований 0,34 нм. На основании этих данных, Уотсон и Крик предложили модель вторичной структуры ДНК, в которой две цепи, состоящие из нуклеотидов, соеди-ненных 3',5'-фосфодиэфирными мостиками, сплетены друг с другом, так что на каждый виток спирали приходится 10 пар оснований. Диаметр спирали 2,0 нм. [20]

Также было установлено, что двойная спираль ДНК может существовать в виде нескольких форм (А, В, С, Z и др.). Указанные формы ДНК различа-ются диаметром и шагом спирали, числом пар оснований в витке, углом наклона плоскости оснований по отношению к оси молекулы. [1]

Гидрофобные пуриновые и пиримидиновые основания обеих цепей уложены стопкой внутри двойной спирали, так что практически плоские молекулы оснований сближены между собой и расположены перпен-дикулярно длинной оси двойной спирали. Пространственное взаиморас-положение цепей приводит к возникновению большой и малой бороздок.

Рисунок 2.1.2 – Двойная спираль  ДНК

 

Основания одной цепи спарены с находящимися в той же плоскости основаниями другой цепи. Внутри этой структуры точно пригнанными оказываются только определенные пары оснований. Такими соответству-ющими друг другу парами всегда являются пары пурин-пиримидин, а именно пары А - Т и Г – Ц. Более того, основания каждой пары настолько сближены, что между ними возникают водородные связи. Такие основа-ния называются комплементарными. Как образуются водородные связи между комплементарными основаниями, показано на рис.2.1.3 .

Рисунок 2.1.3 – Водородные связи в комплементарных основаниях [7]

 

 Комплементарность цепей составляет химическую основу важней-шей функции  ДНК — хранения   и   передачи наследственных признаков. Сохранность нуклеотидной последовательности является залогом безоши-бочной передачи генетической информации. Однако нуклеотидная после-довательность ДНК может подвергаться  мутациями.

Наиболее распространенный вид  мутации — замена какой-либо пары оснований на другую. Одной из причин замены может явиться сдвиг таутомерного равновесия. Например, тимин в лактамной форме не обра-зует водородные связи с гуанином, а в лактимной форме образует, что приводит к замене обычной пары тимин — аденин на пару тимин — гуанин.

Замена «нормальных» пар оснований передается при транскрипции ДНК и приводит в итоге к изменению аминокислотной последовательнос-ти в синтезируемом белке. [18]

Помимо формирования спиральных участков вторичной структуры, нуклеиновые  кислоты способны и к образованию специфической прост-ранственной конфигурации, т.е. третичной структуры. Детальная ин-формация о третичной структуре ДНК пока отсутствует, хотя предпо-лагают, что в ней могут образовываться изломы с нарушением спаривания двух соседних пар оснований и небольшим раскручиванием остова. Повторяясь, через каждые 10 пар оснований такие изломы способны порождать левую сверхспираль с диаметром около 10 нм, каждое звено которой состоит из 10 пар оснований, так что на каждые 140 пар оснований приходится приблизительно 1.5 витка.

Другой тип изломов приводит к образованию правой сверхспирали, содержащей 9.6 пар оснований на виток. Однако в клетке ДНК обычно находится  в постоянном контакте с белками, образуя различные ДНК-белковые комплексы, для формирования которых существенной оказыва-ется вторичная структура ДНК. Образование петель и сверхспиральность помогают обеспечить упаковку очень больших кольцевых молекул ДНК в малых объемах, не ограниченных мембранами. [10]

 В клетках прокариот ДНК подвергается циклизации с образованием кольцевой структуры (рис. 2.1.4). Эта кольцевая молекула подвергается суперспирализации, после чего прикрепляется к особым участкам клеточной мембраны. При сверхспирализации создается впечатление, что двойная спираль прежде, чем концы ее цепей соединились в кольцо, была частично раскручена. Это обратное скручивание сообщает кольцевой молекуле ДНК вращающий момент, вследствие чего она закручивается сама на себя. Если такую сверхспиральную ДНК, в которой запасена дополнительная энергия, подвергнуть действию эндонуклеазы, разрывающей одну из цепей, то скрученность, вызванная обратным вращением, снимается и ДНК переходит в свое обычное низкоэнергетическое релак-сированное состояние.

Рисунок 2.1.4 – Сверхспиральная  и релаксированная кольцевая ДНК

 

Сверхспиральность играет важную роль во многих процессах, происходящих с участием ДНК. Некоторые белки и ферменты не связы-ваются с ДНК, если она находится не в сверхспиральной форме. Фер-менты, называемые топоизомеразами, могут регулировать степень сверх-спиральности, увеличивая или уменьшая число сверхвитков. [9]

Важная характеристика замкнутой  кольцевой ДНК - ее порядок зацепления L. Число L указывает, сколько раз одна цепь пересекает дру-гую цепь, если их спроецировать на плоскость. Число L должно быть це-лым. Кручение Т и величина суперспирализации связаны между собой уравнением

L = W + Т,

т.е. находятся в обратной зависимости. Порядок зацепления – топологи-ческая характеристика; она может изменяться, лишь когда в одну или в обе цепи кольцевой ДНК вносятся разрывы. Действительно, были выде-лены ферменты, которые каталитически изменяют величину L. Каталити-ческую активность таких топоизомераз легко выявить с помощью гель-эл-ектрофореза, так как суперспирализованная ДНК имеет большую подвиж-ность, чем релаксированная ДНК. [16]

2.2. Физические свойства ДНК прокариот

Основными физическими  характеристиками ДНК являются раство-римость, вязкость, отношение к действию температура, рН, УФ-излуче-ния, а также оптические свойства  молекулы. Рассмотрим подробнее эти характеристики. 

Раствоимость. Нуклеиновые кислоты в водных растворах всегда сильно отрицательно заряжены, так как сахарофосфатный остов ДНК и РНК имеет отрицательный заряд фосфатных групп, которые депротони-рованы при характерных для клеток значениях рН.

Молекулу нуклеиновой кислоты невозможно представить себе в чис-том виде, поскольку являясь полиэлектролитами, они нуждаются в про-тивоионах. Кроме того, всегда наблюдается сильное связывание молекул обычных растворителей (например, воды) с биополимерами. Поэтому ре-альным объектом в водном растворе всегда является гидратированная мо-лекула, несущая противоионы. Степень взаимодействия нуклеиновых кис-лот с водой не позволяет считать их растворы идеальными ни при каких концентрациях.

Дейстиве УФ-излучения. Все нуклеиновые кислоты сильно погло-щают свет в УФ-области с максимумом ~260 нм. Когда нативность ДНК нарушается, наблюдается заметный гиперхромный эффект — увеличение поглощения. Это изменение отражает уменьшение числа водородных связей. Действие УФ-излучения на организм может привести к мутациям. Частым типом структурных повреждений ДНК, вызываемых УФ-излуче-нием, является образование пиримидиновых димеров в результате кова-лентного связывания соседних пиримидиновых оснований. Реже УФ вы-зывает разрыв водородных связей, образование межцепочечных попереч-ных сшивок.

Оптическое  вращение. Нативная ДНК обладает сильным положительным вращением плоскости поляризации света, которое заметно уменьшается при денатурации.

Вязкость. Растворы нативной ДНК имеют высокую вязкость. Разрушение водородных связей приводит к заметному уменьшению вязкости.

Влияние температуры. Нагревание образца ДНК в определенной ионной среде вызывает увеличение поглощения в УФ-области и снижение оптического вращения и вязкости, отражая разрушение водородных свя-зей между нитями двойной спирали.

Поскольку взаимодействия между основаниями двух цепей  коопера-тивны, подобно взаимодействиям между молекулами в кристалле, упоря-доченная спиральная структура разрушается в пределах небольшого тем-пературного интервала, как это происходит при плавлении кристалла. По этой причине денатурацию двухцепочечной ДНК при нагревании часто называют «плавлением» ДНК, а температуру, при которой денатуриро-вано 50% ДНК,— температурой плавления Т_пл.

Препараты ДНК из разных источников имеют различные Т_пл, которые зависят от абсолютных количеств Г + С и А + Т. Чем выше содержание Г+С, тем выше температура перехода между нативной двойной спиралью   и  одноцепочечной  формой. Определение значений Т_пл при использова-нии для калибровки препаратов ДНК с известным составом позволяет вычислить содержание Г+C и A+T неизвестной ДНК. Такое определение следует проводить при фиксированной ионной силе и рН, так как эти факторы существенно влияют на стабильность ДНК.

Влияние рН. В достаточно широкой области рН характеристическая вязкость ДНК сохраняет неизменное значение. Тем не мение в областях рН<4,5 и рН>8,5 гидродинамические свойства ДНК сильно меняются (рис.2.2.1).

Рисунок 2.2.1 – Зависимость  характерической вязкости от рН для  растворов ДНК при различных ионных силах (М: 1 - 0,006; 2 - 0,023; 3 - 0,1).

 

В области кислых рН наблюдается  резкое уменьшение характеристи-ческой вязкости, свидетельствующее о компактизации молекулы ДНК. Параллельно происходит некоторое уменьшение коэфицента молекуляр-ной экстинкции. Подробное исследование зависимости коэффициента экс-тинкции от рН среды показало, что по крайней мере до рН = 3,5. ДНК сох-раняет двуспиральную структуру, и наблюдаемый конформационный переход, фиксируемый по изменению характеристической вязкости, не яв-ляется результатом денатурации ДНК. Денатурация ДНК происходит при более низких значениях рН.

В области щелочных рН наблюдается возрастание характеристичес-кой вязкости ДНК с последующим её падением. При это могут изменяться как объемные эффекты, так и персистентная длинна полимеров. [2]

Действие химических реагентов. При контакте с положительно заряженными молекулами происходит внедрение катионов между стоп-ками пар оснований за счёт взаимодействия квазиароматических элект-ронных облаков азотистых оснований с вакантными орбиталями катионов; в результате наблюдается раскручивание (интеркаляция) двойной спирали или суперспирали. Кроме того, такие соединения, как амиды (формамид, мочевина), увеличивая сольватацию ароматических ядер азотистых осно-ваний молекулами воды, также способствуют разрыву водородных связей между основаниями.

Описанные выше нарушения  вторичной структуры ДНК за счет разрыва водородных связей получили название денатурации. Денатурация  нуклеиновых кислот может быть обратимым процессом; скорость ренату-рации тем больше, чем меньше степень денатурации. Например, при пол-ной денатурации ДНК нагреванием две комлементарные нити ренатури-руют очень медленно (происходит так называемый "отжиг ДНК”) и только при медленном охлаждении раствора ДНК. При быстром охлажде-нии степень ренатурации невелика. 

2.3. Формы ДНК в клетках прокариот

Как уже говорилось  ДНК является первичным носителем  наследст-венной информации у всех живых организмов. Эта информация заклю-чается в генетическом аппарате (геноме) организма. Под понятием генома у бактерий обычно подразумевается хромосома, образующая в бактерии-альной клетке особую органеллу — нуклеоид. Помимо хромосомы в генофонд, которым фактически располагает клетка, входит и внехромо-сомная ДНК. [17]