Лабораторная диагностика инфекций, передаваемых половым путём

     Заполненные и закрытые смесители помещают в  специальный штатив. На каждый смеситель  надевают нумерованные кольца из картона. Смесители помещают в термостат  при +35°С на 18-20 ч. Для регистрации опыта через 18 ч смесители вынимают из термостата попарно - опыт и контроль.

     Подсчет подвижных и неподвижных трепонем. По количеству смесителей в штативе  расставляют и нумеруют пробирки. Содержимое смесителя выливают в  соответствующую нумерованную пробирку, перемешивают тем же смесителем с  надетой на него пипеткой и наносят  каплю взвеси с активным комплементом на левую сторону предметного  стекла, а на правую сторону –  с инактивированным комплементом той  же сыворотки; посредине стекла ставят номер сыворотки. Капли накрывают  покровными стеклами. Капли должны быть небольшими, иначе трепонемы  «плывут» с током жидкости, и тогда  суждение об их подвижности и подсчет  затруднительны. Учет результатов реакции  начинают с инактивированного комплемента. Подсчитывают 25 - 30 трепонем и отмечают, какое количество среди них подвижных и какое – неподвижных. Если в контроле содержится меньше 17 подвижных трепонем из 25 сосчитанных, то такой опыт непригоден и его следует повторить. В пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвижности трепонем объясняется не иммобилизацией, а токсичностью сыворотки или недостаточно высоким качеством среды сохранения.

     При определении подвижности трепонем следует учесть, что движения трепонем различны. Они могут обладать весьма активной подвижностью, особенно отчетливы сгибательные движения, а иногда отмечаются только винтовые движения. Иногда трепонема лежит как бы неподвижно, но если присмотреться, то видно, что через некоторое время она начинает активно двигаться. Следует также уметь отличать активные движения трепонемы от движения с током жидкости.

     В пробирках, в которые вылили содержимое смесителей, в дальнейшем определяют остаточный комплемент (во всех пробирках  опыта и контроля). Пробирки с  инактивированным комплементом служат как бы контролем для сравнения  происшедшего гемолиза.

     Расчет  специфической иммобилизации производят по следующей формуле:

     (Число  подвижных трепонем в контроле  – число подвижных трепонем  в опыте) / Число подвижных трепонем  в контроле * 100.

     Реакция иммобилизации считается положительной, когда % иммобилизации выше 51; от 31 до 50% – слабоположительной; сомнительной – от 21 до 30% и отрицательной – ниже 20%.

     Опыт  с сомнительными, а иногда и слабоположительными  результатами следует повторить; при  этом можно получить или положительный, или отрицательный результат. Неудовлетворительным считается результат, если имеется  большое бактериальное загрязнение  или отмечается токсичность сыворотки. Такие исследования следует повторить  с новой порцией сыворотки. Целесообразно  также подвергать повторному исследованию все сыворотки, давшие полное расхождение  со стандартными серологическими реакциями. Эти сыворотки заслуживают особого  внимания, так как в таких случаях  результаты РИБТ могут дать опору  для суждения о наличии или  отсутствии сифилиса.

     При постановке опыта обращают внимание на соблюдение стерильности и чистоты  посуды. Она должна быть свободна от примеси веществ, могущих оказать  вредное влияние на жизнеспособность трепонем. Смесители и всю посуду моют сначала холодной водой, затем  горячей, споласкивают дистиллированной водой, не применяя никаких дезинфицирующих средств. Смесители стерилизуют в автоклаве, подсушивают в сушильном шкафу.

8. Реакция иммунного прилипания бледных трепонем (РИП)

     Основана на том, что вирулентные тканевые трепонемы, сенсибилизированные сывороткой больного сифилисом, в присутствии комплемента и эритроцитов прилипают к поверхности эритроцитов и при центрифугировании увлекаются с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости.

     Для постановки реакции используются: испытуемая сыворотка, антиген, комплемент, эритроциты донора, изотонический раствор натрия хлорида. Кровь берут из вены и  обрабатывают, как для реакции  Вассермана. Сыворотку крови инактивируют в водяной бане при +55-56°С в течение 30 мин. В качестве антигена используют взвесь бледных трепонем штамма Никольса.

     Техника постановки. Предварительно для реакции  разводят все ингредиенты. На дно  центрифужной пробирки микропипеткой  наливают 0,05 мл испытуемой сыворотки, добавляют 0,35 мл смеси комплемента (0,05 мл) с антигеном (0,3 мл). Пробирки энергично встряхивают в течение 30 сек. и оставляют при комнатной температуре на 30 мин; затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси эритроцитов, пробирки энергично встряхивают в течение 30 сек. и оставляют в термостате при +37°С на 30 мин, после чего все пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 мин.

     Учет  результатов проводят путем подсчета бледных трепонем в надосадочной жидкости. Для этого 0,01 мл надосадочной жидкости микропипеткой наносят  на предметное стекло, покрывают покровным  стеклом и в темном поле зрения подсчитывают число бледных трепонем в 10 полях зрения. При просмотре  препарата под микроскопом учитываются  только те бледные трепонемы, которые  могут свободно перемещаться с током  жидкости. Те же трепонемы, которые  попали в поле зрения с током жидкости дополнительно, после начала подсчета («приплывшие»), в этом поле зрения уже не учитываются. Процент прилипания бледных трепонем исчисляется по формуле: 

     (100 – О_n) /K * 100, 

     где O_n – число бледных трепонем в 10 полях зрения из опытной пробирки;

     К – число бледных трепонем в 10 полях зрения из контрольной пробирки.

     При иммунном прилипании бледных трепонем, равном 0 - 20%, результат расценивается как отрицательный; 21 - 30% - сомнительный; 31 - 50% - слабоположительный и при 51 - 100% - положительный.

     В ответе результат реакции выписывается без указания процента. В случае несовпадения результатов РИП с данными других реакций необходимо провести повторный учет результатов РИП с вновь приготовленным препаратом, повторить постановку реакции с этой же сывороткой крови, при необходимости повторить РИП с сывороткой крови, взятой у обследуемого повторно.

     РИП следует применять в следующих  случаях: при диагностике тех  форм сифилиса, когда на основании данных анамнеза, клиники, результатов КСР и других исследований не удается подтвердить диагноз заболевания; при дифференцировании неспецифических результатов КСР; при контрольном наблюдении после окончания лечения. Специфичность и чувствительность РИП близки РИБТ и РИФ.

9. Реакция гемагглютинации с бледными трепонемами (ТРПГА)

     Принцип метода заключается в следующем: формалинизированные тонизированные бараньи эритроциты соединяются  с экстрактом из патогенных бледных  трепонем. Образующийся комплекс, который  фиксируется на эритроцитах, составляет корпускулярный антиген. При соединении антигена с сывороткой, содержащей гомологичные антитела, образуется иммунный комплекс, который вызывает агглютинацию эритроцитов.

     Предварительный результат может быть зарегистрирован  после инкубации в течение 3 - 4 ч. Появление равномерной розовой окраски указывает на положительный результат, а агглютинат (преципитат) темно-красного цвета в виде пятна или кольца является показателем осаждения эритроцитов. ТРПГА-тест, выполняемый вручную или автоматизированным методом, является специфичным и чувствительным тестом.

10. Реакция микрогемагглютинации с бледными трепонемами (МНА-ТР)

     Является вариантом ТРПГА. Ее ставят на пластинках для микротитрования. Она требует по сравнению с ТРПГА меньшего количества сыворотки, адсорбирующего разбавителя и антигена. Окончательный результат получают после 4 ч инкубирования сыворотки. Автоматизированная реакция микрогемагглютинации с бледными трепонемами (АМНА-ТР) благодаря автоматизации процессов заполнения тест-пластин и разведения сыворотки проще и обходится дешевле, чем реакция АМН-ТР. Пригодна при массовых обследованиях на сифилис.

     Клиническая оценка результатов серологических реакций

     При первичном серонегативном периоде  сифилиса бывают положительными РИФ  и реакция Колмера как наиболее чувствительные серореакции. Однако это  не является основанием для постановки таким больным диагноза первичного серопозитивного сифилиса. У ряда больных в этом периоде бывает изолированный положительный результат  при постановке реакции Вассермана с трепонемными или с кардиолипиновым  антигенами. В конце 3-й или в течение 4-й недели после появления первичной сифиломы становятся положительными стандартные серологические реакции - с этого момента начинается первичный серопозитивный период сифилиса. На 1 – 2-й неделе первичного серопозитивного сифилиса отмечается увеличение степени позитивности серореакции (1+, 2+, 3+) и нарастание титра реагинов (1:5, 1:10, 1:20). РИФ и реакция Колмера у всех больных дают резко положительный результат, но РИБТ отрицательная или процент иммобилизации очень низок. Диагноз первичного серопозитивного сифилиса ставится тем больным, у которых осадочные реакции и реакция Вассермана с неспецифическими антигенами дали однократный слабоположительный результат. При дальнейшем течении первичного сифилиса все серологические реакции становятся резко положительными (4+); титр реагинов достигает 1:80, 1:160, РИФ продолжает быть резко положительной, но РИБТ у большинства больных еще остается отрицательной или может стать слабоположительной.

     При вторичном свежем сифилисе резко  положительный результат по всем стандартным серологическим реакциям наблюдается почти в 100% наблюдений; титр реагинов наиболее высок - 1:160; 1:240 или 1:320. РИФ - 4+; РИБТ дает положительнй результат более чем у половины больных, однако процент иммобилизации трепонем невысок (40 - 60%).

     При вторичном рецидивном сифилисе положительный  результат по стандартным серологическим реакциям отмечается в 96 - 98%. Отрицательные результаты объясняются малосимптомным рецидивным течением, наличием астенизации, сочетанием сифилиса и ВИЧ-инфекции. РИБТ дает положительный результат у 85 - 90% больных при выраженной степени иммобилизации: 80 – 90 - 100%.

     Третичный сифилис характеризуется положительными результатами по стандартным серологическим реакциям в 50 - 90% наблюдений и положительной РИБТ у 92 - 100% пациентов с высоким процентом иммобилизации.

     Диагноз скрытого серопозитивного сифилиса устанавливают только по положительным  серореакциям в крови с обязательным подтверждением их по РИБТ, т.к. только РИБТ (в меньшей степени РИФ) позволяет отдифференцировать ложноположительные серореакции (даже с позитивностью в 2+ или 3+) от истинно положительных.

     Разные  формы сифилиса нервной системы  и висцерального сифилиса имеют  различную частоту и выразительность  стандартных серореакции. Так, прогрессивный  паралич в 100% случаев сопровождается резко положительными всеми стандартными серологическими реакциями. Сифилис  сосудов мозга, спинная сухотка, сифилитическое поражение сердечнососудистой системы сопровождаются положительными серореакциями лишь в 40-50-60%. Однако РИБТ почти при всех перечисленных патологических состояниях дает резко положительный результат (90 - 100% иммобилизации).

     При диагностировании врожденного сифилиса в первые 2 мес. после рождения стандартные серологические реакции у ребенка не определяют, т.к. они могут быть положительными за счет пассивной передачи реагинов через плаценту. По этой же причине не имеет значение и положительный результат РИБТ. Пассивно переданные от матери ребенку имобилизины самопроизвольно исчезают в течение 6 мес. после рождения. Если ребенок инфицируется незадолго до родов, то в этом случае РИБТ будет еще отрицательной, несмотря на наличие в организме ребенка сифилитической инфекции.

     При врожденном сифилисе детей грудного возраста с активными проявлениями стандартные серореакции могут  быть отрицательными в 1% наблюдений.

     При врожденном сифилисе раннего детского возраста отрицательные стандартные  серореакции варьируют от 15 до 20%, но в этих случаях РИБТ дает положительные  данные у 90 - 98% детей.

     При позднем врожденном сифилисе при  наличии активных проявлений стандартные  серореакции констатируются лишь у 70 - 80% обследованных, но РИБТ четко положительная у 100% больных с высоким титром иммобилизинов.

     Современные усовершенствованные  серореакции с использованием принципов иммуноферментных констант

     Несмотря  на значительное количество тестов для  серодиагностики сифилиса, их высокую  чувствительность и специфичность  имеется ряд состояний при  которых данные серодиагностики  требуют проверки и дополнительных исследований. Например, у пациентов, полноценно леченных по поводу сифилиса, иногда длительное время остаются положительными серореакции. Это объясняется состоянием серорезистентности, которое до настоящего времени не получило научной трактовки. Затрудняется также дифференциальная диагностика неведомого сифилиса от рецидива процесса и реинфекции. С  целью разработки информативных  вариантов серореакции были использованы детали антителообразования у больных  сифилисом, с предложением и исследованием  вариантов серореакции: метод иммуноферментного  анализа (ИФА), метод иммуноблоттинга (IgM-серология), полимеразная цепная реакция (ПЦР).