Лабораторная диагностика инфекций, передаваемых половым путём

     Иммуноферментный  анализ

     Широко используется для диагностики сифилиса. Принцип реакции заключается в соединении сифилитического антигена, сорбированного на поверхности твердофазного носителя, с антителом испытуемой сыворотки крови и выявления специфического комплекса антиген-антитело с помощью антивидовой иммунной сыворотки, меченной ферментом. Взаимодействие фермента с субстратом дает цветную реакцию, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител.

     Тест  для выявления IgG - тест-ловушка использует в качестве антигена очищенные патогенные трепонемы. У больных с вторичным, ранним и поздним сифилисом и нейросифилисом и у реинфицированных пациентов чувствительность теста 100%. Тот же принцип ловушки для антител применен с целью определения сывороточных IgM.

     Метод иммуноблоттинга

     При проведении иммуноблоттинга трепонемы  подвергаются электрофорезу с разделением  белковых иммунодерминант на нитроцеллюлозе. Затем производится обработка разделенных  точек исследуемой сыворотки  и антителами к IgG либо IgM, меченными  ферментами или радиоактивными веществами.

     lgM-серология.

     При изучении антителообразования в  организме больных сифилисом  установлено, что первыми после  заражения вырабатываются специфические IgM, выявляемые уже на 2-й нед. после заражения и достигающие максимальной концентрации в крови на 6 - 9 нед. Через 6 мес. после окончания терапии у большинства больных в крови они не определяются, На 4-й нед. после инфицирования организм начинает продуцировать специфические IgG. Этот вид иммуноглобулинов в наибольшем количестве определяется через 1 - 2 года после заражения. Заслуживает особого внимания то, что специфические IgM перестают вырабатываться при исчезновении из организма антигена, а секреция IgG продолжается клонами клеток памяти. Кроме того, крупные молекулы IgM не проходят через плаценту от матери к плоду, в связи с чем по их наличию у ребенка судят об его инфицировании бледной трепонемой.

     Ввиду того, что концентрация в крови  специфических IgM закономерно снижается  после эффективного лечения, рост титра  этих антител может служить вспомогательным  признаком наличия рецидива заболевания  или реинфекции.

     Полимеразно цепная реакция (ПЦР)

     Метод заключается в многократном увеличении (амплификации) количества ДНК выявляемого  микроорганизма. Разработка вариантов  ПЦР для диагностики сифилиса обусловлена недостаточностью стандартных  тестов при раннем серонегативном, врожденном сифилисе и нейросифилисе. ПЦР является превосходным методом  для диагностики сифилиса при  небольшом количестве трепонем в  исследуемом материале. Достоинством ПЦР является возможность автоматизации реакции путем заданного циклического температурного режима для определяемой за счет меченных праймеров цветной реакции. Остается невыясненным вопрос – отражает ли наличие трепонемной ДНК присутствие жизнеспособных трепонем или это могут быть остатки погибших микроорганизмов, содержащие способную к амплификации ДНК.

     Применение  ПЦР может иметь большое значение при диагностике врожденного  сифилиса, нейросифилиса, первичного серонегативного  сифилиса, а также у больных, у  которых диагностика сифилиса с  помощью обычных серологических реакций затруднена из-за инфицирования ВИЧ.

     Исследование спинномозговой жидкости

     Особое  внимание уделяется исследованию спинномозговой жидкости для определения пораженности сифилисом нервной системы, как  критерий качества лечения у лиц  с патологическими изменениями  в ликворе до начала лечения и  как один из критериев излеченности больных.

     Ликвор получают при люмбальной пункции. В пробирку собирают 7 - 8 мл (но не более 10 мл) ликвора. Это количество распределяют в две пробирки, одну из которых направляют в клиническую лабораторию, а другую – в серологическую.

     В клинической лаборатории исследуют  цитоз, содержание белка, глобулиновые реакции Панди и Нонне-Апельта. Минимальные патологические изменения в спинномозговой жидкости следующие: содержание белка, начиная с 0,4%, цитоз - 8 клеток в 1 мкл, глобулиновые реакции (реакция Нонне-Апельта++, реакция Панди+++; реакция Ланге - больше 2-х 2-ек в цифровом значении, положительная РВ). Показатели выше указанных, будучи изолированными, свидетельствуют о выраженных патологических изменениях в спинномозговой жидкости. Патологической считается также ликвор, в котором несколько показателей изменены соответственно данным минимальной патологии, а РВ положительна. Концентрация белка в ликворе свыше 400 мг/л и число клеток более 5000 на 1 л свидетельствуют о воспалительном процессе в ЦНС. Для обозначения позитивности глобулиновых реакций и РВ применяется система четырех плюсов; резко положительный результат (4+), положительный - 3+, слабоположительный - 2+ и сомнительный - 1+.

     В серологической лаборатории ставятся РВ, реакция Ланге с коллоидным золотом, РИТ, РИФ, РИФ-ц, ТРНА, либо FTAABS, либо IgM TPHA. Отрицательная ТРНА, либо FTAABS исключает нейросифилис. Положительная IgM TPHA со спинномозговой жидкостью и индекс ТРНА свыше 10 подтверждают наличие сифилитического процесса в ЦНС. Использование РИФ целесообразно при ликвородиагностике сифилиса. Особенно высокочувствителен и специфичен тест с цельным ликвором (РИФ-ц). Применение РИФ РИБТ и IgM ТРНА расширяет возможности выявления сифилитического поражения нервной системы.

     При ранних формах нейросифилиса более  выражены количественные отклонения цитоза, концентрации белка, сочетающиеся с  минимальной патологией коллоидной реакции. Тяжелые паренхиматозные  сифилитические поражения головного  и спинного мозга сопровождаются выраженными изменениями коллоидных реакций до пяти или шести «шестерок» в реакции Ланге. Реакция Вассермана в спинномозговой жидкости иногда может  быть ложноотрицательной или ложноположительный. Положительные неспецифические  данные реакции Вассермана в спинномозговой жидкости могут наблюдаться при  опухолях мозга, эхинококкозе, цистицеркозе, рассеянном склерозе и паркинсонизме. 

2 Гонорея 

     Гонорея – венерическое заболевание, передаваемое в основном при интимных контактах, вызываемое гонококком.

     Морфология, устойчивость и культуральные свойства гонококков

     Возбудитель грамотрицательный диплококк, адсорбирующийся на поверхности эпителиальных клеток, способный проникать в межклеточные щели с образованием микроколоний, защищенных от воздействия антител и клеточных факторов иммунитета. Характерно внутриклеточное расположение возбудителей в сегментоядерных лейкоцитах на всех стадиях процесса, особенно при обильном гнойном отделяемом. Эндоцитобиоз – внутриклеточная персистенция гонококков позволяет оставаться недоступными действию антибиотиков. В организме больных гонококки претерпевают L-трансформацию после применения химиотерапевтических средств или при хроническом течении заболевания.

     На  ультратонких срезах у гонококков выявляются клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, цитоплазма с множественными рибосомами, многочисленными полирибосомами, лизосомами и нуклеоид с нитями ДНК. На поверхности гонококков выявляются тонкие трубчатые нити – пили. Им приписывают способность гонококков передавать генетические свойства, в  частности, устойчивость к антибиотикам, способность прилипать к клеткам  эпителия хозяина и ряд других биологических особенностей. С пилями, по-видимому, связан механизм передачи генетической информации к способности переноса плазмид и β-лактамазопродуцирующих штаммов гонококков. Устойчивость β-лактамазопродуцирующих гонококков к антибиотикам обусловлена полиантибиотикорезистентностью, и такими адаптационными механизмами как L-трансформация, образование спороподобных форм и др.. Помимо штаммов, образующих β-лактамазопродуцируюших клонов гонококков, существуют штаммы трансформирующиеся в L-формы. Для начальной стадии L-трансформации характерен множественный нуклеоид с последующим истончением наружной стенки, потерей ее структуры и фестончатости. L-трансформация может происходить спонтанно или при действии антибиотиков. После прекращения действия препарата, вызвавшего образование L-форм, наступает реверсия. При L-трансформации между наружной стенкой и цитоплазматической мембраной образуются элементарные тельца – округлые образования разной величины, из которых образуются типичные гонококки. Именно биологическое свойство образовывать нестабильные варианты L-форм рассматривается как одна из наиболее частых причин рецидивов болезни. Отдельные штаммы гонококков вырабатывают фермент пенициллиназу, что объясняет их устойчивость к пенициллину и его дериватам.

     2.2 Формы гонорейной инфекции

     Патологический  процесс чаще ограничивается местом первоначального внедрения возбудителя. В связи с этим принято различать  гонорею:

• мочеполовых органов (генитальная),
• экстрагенитальную (гонорея прямой кишки, глотки, рта, миндалин, глаз)
• метастатическую (диссеминированная), являющуюся осложнением двух первых.

     2.3 Диагностика гонококковой инфекции

     В диагностике гонореи решающее значение имеют лабораторные данные. Этиологическая диагностика проводится с использованием бактериоскопических и бактериологических методов. Если в препарате при  бактериоскопии обнаружены типичные гонококки, то культуральное исследование не проводится. Топическая диагностика применяется  обязательно для точного определения  локализации воспалительного процесса в уретре с помощью двухстаканной  пробы. Более точная топическая диагностика  осуществляется методом уретроскопии, но этот способ исследования рекомендуется  применять только при хронической  форме процесса, так как при  острой форме данная процедура может  способствовать распространению инфекции в вышележащие отделы мочеполовой  системы.

     Методы  лабораторной диагностики гонококковой инфекции:

• микроскопические (бактериоскопические),
• культуральные (бактериологические).
• молекулярно-биологические.

     2.3.1 Микроскопические методы исследования

     В случае если нефиксированный препарат доставляется в лабораторию: препарат фиксируют 96⁰ спиртом или трехкратным проведением стекла через пламя горелки.

     Хранение  мазков:

     Фиксированные препараты можно хранить при  комнатной температуре в течение  нескольких дней.

1. Окраска метиленовым синим:

     Окраска метиленовым синим является ориентировочной  и позволяет оценить морфологию и расположение микроорганизмов  в мазке. Можно использовать водный или спиртовой растворы метиленового синего. Использование спиртового раствора позволяет сократить время фиксации препарата, не снижал качества окраски.

2. Окраска по методу Грама:

     При окраске по методу Грама в препарате  выявляются тинкториальные свойства бактерий. В зависимости от химической структуры  клеточной стенки (наличие или  отсутствие тейхоевых кислот) бактерии либо обладают способностью удерживать комплекс кристаллического фиолетового с йодом и устойчивы к обесцвечиванию спиртом (грамположительные), либо нет (грамотрицательные).

3. Микроскопия окрашенных препаратов.

     При проведении микроскопического исследования последовательно оцениваются препараты, окрашенные двумя способами: метиленовым  синим и по Граму. Нельзя выносить заключение по результатам просмотра лишь одного препарата.

     Окраска метиленовым синим позволяет  сделать заключение о наличии  воспаления и выявлении морфотипа  бактерий. При окраске по Граму  возможно выявление грамотрицательных  диплококков. При микроскопии препаратов врачом-лаборантом оценивается наличие  эпителия, количество лейкоцитов, эритроцитов, морфотип бактерий (лактобациллы, кокки, коккобациллы), наличие вне- и внутриклеточно расположенных диплококков.

     Мазки, окрашенные метиленовым синим или  по Граму, оцениваются при двух увеличениях (с применением объективов xl0, х100, т.е. при увеличении соответственно в 100 и 1000 раз). Микроскопическое исследование следует начинать с малого увеличения (х100), позволяющего обнаружить клинический материал на стекле, оценить адекватность взятия из соответствующего анатомического участка, определить наличие «загрязнений» из других анатомических участков, выбрать участок препарата для дальнейшего исследования при большом увеличении (х1000). Микроскопия при большом увеличении позволяет выявить и оценить воспалительную реакцию и наличие микроорганизмов. При увеличении xl000 с иммерсией подсчет лейкоцитов следует проводить в пяти полях зрения. При этом особое внимание следует уделить поиску внутриклеточных диплококков в лейкоцитах.

     Диагноз уретрита у мужчин устанавливается  на основании обнаружения 4 и более  лейкоцитов в поле зрения микроскопа при увеличении xl000. При наличии цервицита количество полиморфно ядерных лейкоцитов повышено (более 10 при увеличении х1000). При клиническом исследовании следует принимать во внимание наличие или отсутствие слизисто-гнойных цервикальных выделений (зеленовато-желтый гной со слизью на белом ватном тампоне).

     При исследовании вагинального мазка у  женщин нужно помнить о том, что число лейкоцитов зависит от индивидуальных особенностей организма - от дня менструального цикла, наличия внутриматочной спирали и т.д. Поэтому для диагностикки слизисто-гнойного цервицита рекомендуется использовать оба критерия, т.е. наличие клинических проявлений и воспалительный характер цервикального мазка.