Лабораторная диагностика инфекций, передаваемых половым путём

     Окраска по Романовскому-Гимзе: краску Романовского-Гимзе  разводят в соотношении 1:10 фосфатным  буфером с рН 7.2 - 7.6 (1 часть краски и 9 частей фосфатного буфера) и наносят  на мазок на 1 - 2 часа, далее препарат промывают под проточной водой, прополаскивают дистиллированной водой, дифференцируют, погружая на 1 - 3 секунды в 96% этиловый спирт, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы при общем увеличении микроскопа в 900 - 1500 раз (ок. 10-15, об. 90-100).

     При микроскопии ЭТ хламидий представляют собой мелкие (0.15 - 0.3 мкм) образования округлой формы, окрашенные в розовый или красноватый цвет. Они могут находиться как внеклеточно (преимущественно), так и внутриклеточно. Более крупные РТ (0.5 - 1.5 мкм) окрашиваются в различные оттенки от голубого до темно-синего цвета и находятся внутриклеточно, при микроскопическом исследовании они обнаруживаются в виде скоплений вокруг ядра эпителиальной клетки в форме “шапочки жандарма” или диффузно.

     Ядра  клеток при данной окраски имеют вишневый оттенок различной интенсивности, а цитоплазма прокрашивается в нежно-голубой цвет.

     Окраска по Маккиавелло: мазок-отпечаток на предметном стекле фиксируют над  пламенем горелки несколько секунд и далее окрашивают 0.25% раствором  основного фуксина в течение 5 минут. Затем краску смывают под  проточной водой. Препарат помещают на несколько секунд в 0.5% раствор  лимонной кислоты и затем промывают  под проточной водой. Последний  этап - дополнительное окрашивание 1% раствором  метиленового синего в течение 20 - 30 сек, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы при общем увеличении микроскопа в 900 - 1500 раз.

     Ядра  клеток окрашиваются в бледно-розовый  цвет, цитоплазма - в нежно-голубой. РТ (внутриклеточные) окрашиваются в различные оттенки голубого цвета (от светлого до темного), ЭТ имеют красноватый цвет и могут находиться как внутриклеточно, так и внеклеточно (преимущественно).

     Цитологические  методы просты в выполнении, дешевые, не требуют сложного оборудования, больших временных затрат, специальной  подготовки и дополнительных навыков  у лаборантов и врачей-лаборантов, владеющих техникой световой микроскопии. Однако их диагностическая значимость очень низкая: у больных мужчин диагностировать хламидийную инфекцию цитологическим методом в соскобах из уретры удается лишь в 10 - 15% случаев, а у женщин - до 30 - 40% случаев (в соскобах из цервикального канала).

     В тоже время цитологический метод  позволяет выявить неспецифические  морфологические изменения эпителиальных  клеток, которые могут косвенно свидетельствовать  о наличии поражения урогенитального  тракта, в том числе и хламидийной  этиологии. Нормальные эпителиальные  клетки имеют круглое ядро диаметром 10 - 15 мкм, цитоплазма при окраске по Романовскому-Гимзе прокрашивается в голубой цвет, хроматин - в пурпурный. Сама клетка - округлой формы, диаметр ее достигает 20 - 25 мкм. В соскобах у больных с хламидийной урогенитальной инфекцией могут быть следующие морфологические изменения эпителиальных клеток: клетки увеличены в размере, диаметром до 30 мкм и более, цитоплазма их нередко вакуолизирована, может иметь включения различного размера - от 0.3 до 0.5 мкм и более. Иногда можно наблюдать клетки с явлениями фагоцитоза. В клетках происходит изменение морфологии ядра: отмечается полиморфизм, макронуклеоз - увеличение ядра до 15 мкм и более, полинуклеоз (2 и более ядер в клетке). В соскобах также могут встречаться лимфоциты, полиморфноядерные лейкоциты, плазмоциты и мононуклеарные клетки. Выраженность морфологических изменений часто коррелирует с выраженностью патологического процесса.

     Описанные клеточные изменения могут служить  косвенным признаком хламидийной  инфекции. Цитологический метод пригоден для проведения массовых и первичных  обследований урологических и гинекологических больных с последующим обследованием  их более специфическими и диагностически значимыми методами при получении  патологических или сомнительных результатов.

     Методы, в основе которых лежат иммунологические реакции

     Данная  группа методов основана на комплементарном  взаимодействии специфического антигена (АГ) с антителом (АТ) с последующим  проявлением продукта флюорохромом или посредством цветной биохимической  реакции.

     При диагностике урогенитального хламидиоза можно определять в биологическом  материале либо наличие родоспецифического (группового) антигена (в моче, отделяемом половых органов, в материале  из соскоба), либо специфические антихламидийные  антитела - иммуноглобулины различных  классов: А, М, G - в сыворотке крови. Для этого используют два основных метода: иммуноферментный анализ (ИФА) и реакцию иммунофлюоресценции (РИФ).

1. ИФА

     ИФА известен давно и широко применяется  для диагностики в инфекционной патологии. В настоящее время  на рынке диагностических тест-систем предлагается большое количество наборов  как зарубежных, так и отечественных  фирм-производителей. Методом ИФА  определяют наличие и титр (либо количество) противохламидийных антител - иммуноглобулинов различных классов  в сыворотке крови обследуемого. Хламидии обладают слабой антигенной активностью, вследствие чего выработка и накопление антител в организме происходит в малых количествах. Кровь для исследования следует брать в период ярких клинических проявлений преимущественно системного характера. Сыворотку, полученную после центрифугирования, при необходимости можно хранить при +4 - +8°С до 5 дней, либо при -20°С 1 месяц. Рекомендуется исследовать парные сыворотки для выявления динамики титра антител в процессе течения заболевания и проводимого лечения. Наборы ИФА-метода содержат в своем составе положительный и отрицательный контроли, по соотношению с которыми судят о наличии или отсутствии специфических антител и их количестве в сыворотке крови обследуемого. Методика постановки ИФА приводится в инструкции к каждому конкретному набору и включает этапы:

     1. Инкубация соответствующего разведения  сыворотки крови обследуемого  на планшете (или с шариком  в пробирке) сенсибилизированным  родоспецифическим хламидийным  антигеном для взаимодействия с ним специфических противохламидийных антител (иммуноглобулинов) - образование комплекса антиген-антитело (АГ - АТ);

     2. Отмывание планшета (шарика) от непровзаимодействовавших  иммуноглобулинов;

     3. Инкубация образовавшегося комплекса  АГ-АТ с антисывороткой к иммуноглобулинам  человека (общим или какого-либо  определенного класса, в зависимости  от того - определяется ли просто  факт наличия АТ к хламидиям  или наличие АТ, относящихся к  определенному классу иммуноглобулинов  А, М, G), меченой ферментом;

     4. Отмывание планшета (шарика) от непровзаимодействовавших  меченых антител;

     5. Проведение ферментативной биохимической  реакции в результате которой  образуется цветной продукт. Интенсивность  окраски раствора соответствует  количеству фермента в реакционной  смеси, следовательно количеству  образовавшихся комплексов АГ-АТ, число которых определяется содержанием  противохламидийных антител в  сыворотке крови обследуемого. Количество  окрашенного продукта промеряют  на ридере (специальный фотоколориметр).

     В последнее время появились ИФА  тест-системы, в которых на 3 этапе  используют антитела, меченые флюорохромами. В этом случае 5 этап не проводят, количество антихламидийных антител определяют измерением свечения образовавшихся сложных  комплексов АГ-АТ-меченое АТ на ридере флюориметре.

     Некоторые фирмы предлагают ИФА тест-системы  для обнаружения хламидийного антигена в отделяемом, соскобах из урогенитального  тракта и других локусов (конъюнктива, слизистая прямой кишки и пр.). Биоматериал берут специальными зондами и помещают в транспортную среду для хранения и предварительной  обработки. Дальнейшее проведение анализа  имеет те же этапы, как при исследовании сыворотки крови. Обнаружить хламидийный  антиген ИФА методом удается  у 50-70% больных.

     ИФА методы диагностики хламидийной  инфекции получают все более широкое  распространение в последнее  время. Но необходимо отметить, что  наличие противохламидийных антител  в сыворотке крови свидетельствует  о контакте организма с хламидиями. Обнаружить антихламидийные АТ удается  лишь у 55 - 65% больных, количество ложноположительных результатов может составлять 2 - 5%. Уровень антител зависит как от иммунореактивности организма, так и от скорости их элиминации из организма. Поэтому постановка диагноза хламидиоза по единичному анализу возможна лишь при наличии высокого титра противохламидийных антител преимущественно IgМ класса. Наиболее корректно использовать определение уровня противохламидийных АТ для оценки динамики течения заболевания и корректности проводимой терапии. Для этого проводят исследование парных сывороток крови. Четырехкратное и более увеличение титра АТ свидетельствует об обострении или прогрессировании заболевания. Снижение титра антител в процессе лечения свидетельствует об адекватности и эффективности проводимых лечебных мероприятий. Противохламидийные АТ могут сохраняться в организме после излечения до года и более.

     ИФА методы сравнительно просты в выполнении, не требуют значительных временных  затрат (время реакции от момента  взятия материала до получения ответа составляет 1.5 - 3.5 часа). Однако для их выполнения необходим комплект оборудования для проведения ИФА (инкубатор, шейкер, вошер, ридер и набор автоматических микродозаторов), соответствующее помещение  и подготовка медицинского персонала. Диагностическая значимость (специфичность  и чувствительность) ИФА при урогенитальном хламидиозе составляет 50 - 70% по сравнению с культуральным методом.

2. РИФ

     Реакция иммунофлюоресценции основана на взаимодействии противохламидийного АТ с родоспецифическим  хламидийным антигеном. Существует два типа реакции иммунофлюоресценции - прямой и непрямой. В первом случае непосредственно специфическое антитело мечено флюорохромом и реакция проходит в один этап, что значительно сокращает сроки исследования. Во втором случае специфическое антитело не имеет метки, а для выявления комплекса АГ-АТ, образовавшегося на первом этапе, используют вторые меченые антитела, специфичные к антихламидийным антителам. Результат реакции оценивают визуально при помощи люминисцентного микроскопа.

     Помимо  импортных появились отечественные  наборы для диагностики хламидийной  инфекции реакцией прямой иммунофлюоресценции, которые практически не уступают по специфичности и чувствительности, но имеют значительно более низкую цену.

     Материалом  для исследования служат мазки-отпечатки, приготовленные с соблюдением правил. Мазки для РИФ готовятся на специальных деколированных стеклах в пределах ограниченной площадки диаметром 8 - 10 мм. После этого их высушивают на воздухе и фиксируют, погружая на 5 - 10 минут в холодный 96% (лучше абсолютный) этиловый спирт или нанося на препарат 0.1 - 0.15 мл охлажденного безводного ацетона до полного его испарения. Фиксированные препараты можно исследовать сразу или при необходимости хранить при комнатной температуре в течение суток или при -20°С в течение 2 недель (при этом необходимо исключить доступ влаги при хранении и доведении препарата до комнатной температуры перед исследованием при помощи полиэтиленового пакета и селикагеля).

     При проведении прямой РИФ на препарат наносят раствор меченых антител  в количестве, необходимом для  полного покрытия мазка (25 - 30 мкл). Препарат инкубируют в горизонтальном положении во влажной камере в течение 15 минут при +37°С. Подсыхание реагента недопустимо во избежание ложноположительных результатов. Далее мазок промывают в проточной воде 30 сек, прополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и готовят к микроскопии.

     При проведении непрямой РИФ на препарат наносят необходимое количество раствора антихламидийных антител  и проводят первую инкубацию в  тех же условиях, что и при проведении прямой РИФ. Затем препарат промывают, высушивают на воздухе и наносят  второй реагент - меченые антитела к  хламидийным АТ и проводят вторую инкубацию так же во влажной камере при +37°С 15 минут. После промывания препарат высушивают и готовят к микроскопии. Готовые препараты рекомендуется просматривать сразу. При необходимости возможно хранение окрашенных препаратов в течение 1 - 2 суток при +2-8°С в темном месте без доступа влаги.

     Микроскопию проводят с использованием иммерсионной системы. Возможны два варианта иммерсионной микроскопии:

     1. Масляная иммерсия: На готовые  высушенный препарат наносят  20 - 25 мкл монтирующей жидкости (глицерин, забуференный фосфатным буфером с рН 7.2 - 7.6), покрывают его обезжиренным покровным стеклом, на которое затем наносят каплю нефлюоресцерующего иммерсионного масла и микроскопируют объективом (маркировка “Л” - люминисцентный) с увеличением 90 и окуляром с увеличением 5.

     2. Водная иммерсия: на готовый препарат  наносят каплю 20 мкл фосфатного  буфера с рН 7.4 и микроскопируют  объективом для водной иммерсии (маркировка - белая полоса и “Л”  - люминисцентный) с увеличением  60 и окуляром с увеличением  5. Водная иммерсия дает более  ровное, яркое и четкое свечение.

     РИФ позволяет выявлять антигенные структуры  как элементарных, так и ретикулярных телец. ЭТ расположены преимущественно  внеклеточно, округлой формы с ровными  краями, мелкие (размер 1:100 - 1:150 по отношению  к окружающим их клеткам), однородной структуры, имеют яркое специфическое  изумрудно-зеленое свечение, которое  при работе микровинтом может давать дифракционные кольца (кольца Дилекторского). РТ встречаются значительно реже, располагаются преимущественно внутриклеточно, имеют менее однородную структуру, более полиморфны, но также с четкими краями и обладают ярким специфическим изумрудно-зеленым свечением. Любой другой флюоресцирующий материал неправильной формы, неровными нечеткими краями, имеющий неяркую зеленую окраску, либо свечение другого цвета относится к артефактам. Интенсивность, яркость и оттенок специфического свечения зависит от рН монтирующей жидкости или буфера используемого для микроскопии. Большая интенсивность свечения ФИТЦ в щелочной среде увеличивает чувствительность метода, но ведет к увеличению числа объектов с неспецифическим свечением, а, следовательно, к ложноположительным результатам. В кислой среде интенсивность свечения ФИТЦ падает, что может дать ложноотрицательный результат. Сопутствующая микрофлора, а также ядра окружающих клеток неспецифически окрашиваются в различные оттенки оранжевого цвета бромистым индием, их цитоплазма - в различные оттенки кирпично-коричневого цвета синькой Эванса.