Выделение, индикация и идентификация возбудителя лейкозу крупного рогатого скота

Введение

     Лейкоз  КРС - хроническая инфекционная болезнь  опухолевой природы, основной признак которой - злокачественное разрастание клеток кроветворных органов с нарушением их созревания, в результате чего происходит диффузная инфильтрация органов этими клетками или появляются опухоли.

     Лейкозы животных диагностируют почти во всех странах мира. Наиболее широко они распространены в США, ряде стран  Центральной Европы, Дании, Швеции и  странах Ближнего Востока. Потери от выбраковки туш с опухолевым лейкозом в США в 1978 г оценивали в 7 млн. долларов. Эта сумма не отражает реальных потерь, поскольку не учитывает ущерб от падежа и вынужденного убоя заболевших животных непосредственно на фермах. Экономический расчет показал, что в Великобритании потери от лейкоза за 25 лет могут составить 4,8 млн.фунтов стерлингов. В Турции, куда лейкоз был завезен с племенным скотом из Швейцарии, количество больных животных составило 4,5%. Лейкоз установлен также в Африке и Австралии. В нашей стране возникновение лейкоза связано с завозом племенного скота в 1945-1947 гг. из Германии.

     Симптомы  и патологоанатомические  изменения. Различают 2 основные формы лейкоза КРС: энзоотическую и спорадическую. Последняя форма встречается редко и поражая молодых животных (до 3-летнего возраста), проявляется клинико-морфологическими разновидностями: 1) ювинальный лейкоз (форма лейкоза у телят) - наиболее часто наблюдается у телят моложе 6-мес возраста, характеризуется увеличением лимфатические узлов и часто инфильтрацией костного мозга, 2) тимусная форма лейкоза встречается у телят моложе 2-летнего возраста, характеризуется увеличением тимуса, 3) кожная форма встречается у телят от 1 до 3-летнего возраста, характеризуется узелковой лейкемической инфильтрацией кожи.

     Спорадический лейкоз не представляет особого интереса в экономическом плане. Этиологический агент при этой форме болезни не выявлен.

     Энзоотический лейкоз - контагиозная болезнь с  длительным латентным периодом, во время которого в крови выявляют вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) и AT к нему. В основном встречается у крупных животных, наиболее часто в возрасте 5-8 лет. Болезнь характеризуется пролиферацией неопластических элементов, в результате чего образуются отдельные опухолевые массы и (или) диффузная инфильтрация различных тканей и органов. В опухолевый процесс вовлекаются лимфатические узлы, часто поражаются селезёнка, сычуг, сердце, почки и другие органы. Клинические проявления зависят от вовлечённых в патологический процесс органов, степени опухолевого роста и диссеминации неопластиче.

     Энзоотический лейкоз КРС объединяет две группы болезней. Опухолевые болезни первой группы характеризуются инфильтрацией лимфоцитами органов кроветворения с вовлечением в патологический процесс костного мозга (лимфоидный, миелоидный, слабо дифференцированный и недифференцированный лейкозы с различными вариантами). Болезни второй группы (лимфо-, ретикулосаркома, лимфогранулематоз) сопровождаются опухолевым ростом, первично проявляющимся в лимфоидной ткани (лимфатических узлах, селезенке и других органах). Типично протекающий энзоотический лейкоз в терминальной стадии характеризуется потерей массы, анемией, снижением молочной продуктивности и увеличением одного или нескольких периферических лимфатических узлов. Заболевание неизменно заканчивается смертью животного через несколько недель или месяцев после проявления клинических признаков.

     Патогенез. Патогенез при лейкозе коров изучен недостаточно, АГ вируса обнаруживают только в лимфоцитах инфицированных животных после краткосрочного культивирования in vitro. Считают, что лимфоцитоз - результат поликлональной пролиферации В-лимфоцитов, постоянно стимулированных АГ ВЛКРС. Сравнительный анализ результатов изучения интерфероногенеза лейкоцитами крови у здорового, свободного от ВЛКРС, спонтанно инфицированного вирусом лейкоза с картиной крови в пределах физиологической нормы, а также больного хроническим лимфоидньм лейкозом (ХЛЛ КРС), показал, что титры лейкоцитарного ингерферона в крови спонтанно инфицированных животных снижены в 1,3-2,9, a y больных ХХЛ- в 3,8-9,4 раза по сравнению с клинически здоровыми, свободными от ВЛКРС животными Проведенные исследования показывают, что ВЛКРС обладает иммунодефицитными свойствами, выраженными в данном случае снижением интерфероногенеза в лейкоцитах крови. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Обзор литературы

     Устойчивость. Установлено, что ВЛКРС чувствителен к температурным возденет разрушается при повторных замораживаниях и оттаиваниях и при нагревании до 56°С в течение 15 мин. Пастеризация молока (74°С в течение 16с) разрушает его, и он теряет инфекционность для ягнят. Вирус обнаруживается в молоке после хранения в течение 72 ч. при 1°С, при 10 и 14,5°С его не обнаруживают через 48 и 24 ч соответственно. Полная инактивация вируса в молоке или вируссодержащей жидкости установлена при 50°С в течение 70 мин., при 70-74 °С в течение 17 мин. или при 56-63 °С в течение 5-30 мин. В цельном молоке, хранившемся при 1,1-5,5°С, происходит постепенное снижение титров ВЛКРС в течение 72 ч; при 9,9 и 14,4°С вирус не обнаруживался уже через 48 и 24 ч хранения. В сливках, собранных после отстоя цельного молока, при 1,1°С через 24, 48, 72 ч вирус был выделен только в пробах первых 2-х сроков отстоя. В разбавленном молоке (до 37,5 %) инфекционность сохраняется в течение 12 ч. Если при рН 6,5 вирус сохраняется в молоке в течение 72 ч, то при рН 7,1- только 48 ч. Снижение кислотности молозива до рН 4,5 разрушает вирус в течение 2 ч, особенно при высоких исходных титрах, а в нативном молозиве вирус сохранялся в течение 18 дн. при комнатной температуре. Прямой солнечный свет инактивирует ВЛКРС в течение 4 ч, УФ лучи - в течение 30 мин (120 Вт на расстоянии 1 м ). ВЛКРС полностью теряет активность в р-рах натриевого щелока (0,5° мин, 22°С), этанола (2,0%, 4 ч, 22°С), формальдегида (0,5%, 8 ч, 37°С), фенола (0,5%, 4°С). В жидком азоте лимфоциты, несущие провирусную ДНК, сохраняют инфекционность в течение нескольких лет. Повторное замораживание и оттаивание разрушает клетки и устраняет инфекционность.

     Антигенная  структура. Электрофорез очищенных вирионов ВЛКРС в SDS - ПА и гельфильтрация в присутствии гидрохлорида гуанидина показывают в составе вирионов 4 главных негликозилированных белка и 2 гликозилированных.

     Антигенная  вариабельность. В АГ отношении ВЛКРС отличается от известных вирусов типа С. Не выявлено с помощью ИФ и иммунодиффузии АГ родства между главным внутренним белком ВЛКРС р24 и группоспецифическими АГ вирусов лейкозов мышей и кошек, опухолей молочных желез мышей, вирусов бабуинов, шерстистых обезьян ВЛКРС, являясь экзогенным ретровирусом КРС, отличается от известных ретровирусов по АГ свойствам, морфогенезу, способности индуцировать синцитий в монослойных культурах клеток и по свойствам ревертазы. Кроме того, в отличие от большинства других лейкемогенных вирусов, он присутствует у инфицированных животных в непродуктивном состоянии.

     Локализация вируса, вирусоносительство. ВЛКРС обнаруживается в клетках молозива и молока естественно зараженных животных. Из слюны, носовых истечении, мочи и спермы инфицированных животных его выделить не удалось. Экспериментально и спонтанно зараженный до или после рождения теленок остается инфицированным всю жизнь, несмотря на постоянное присутствие ВНА, выявляемых в РДП, РСК и других серологических реакциях. Отсутствие экспрессии генома ВЛКРС при наличии транскрипционных противирусов в опухолевых клетках дало возможность предположить, что причиной опухолевой трансформации клеток ВЛКРС является нарушение структуры клеточного генома. Неспособность AT элиминировать ВЛКРС объясняется тем, что этот вирус обычно присутствует в инфицированных лимфоцитах в непродуктивном состоянии и защищен от действия AT. Размножение его не является необходимым для распространения в популяции животных. Инфицированные лимфоидные клетки могут передавать вирусный геном потомству во время размножения клеток.

     Антигенная  активность. Инфицированные ВЛКРС животные вырабатывают AT к нескольким вирионным АГ. Впервые для выявления АГ этого вируса в цитоплазме продуцирующих вирус лимфоцитов КРС был использован метод непрямой ИФ с использованием сыворотки больного лейкозом КРС. В дальнейшем было показано, что выявляемый этим методом АГ является вирионным компонентом, несущим АГ детерминанты, присутствующие в главном внутреннем вирионом белке р24. В сыворотке крови больных лейкозом коров обнаружены КСА, к 4-м вирусным полипептидам: р15, р24, gp30, и gp51. В сыворотке крови телят и ягнят, родившихся от больных лейкозом животных, имеется высокий уровень специфических антител, сохраняющийся в течение 5-6 мес. после рождения у телят и 3 мес. у ягнят. Наличие высокого титра колостральных антител способно нейтрализовать инфекции ВЛКРС и предотвратить заражение новорожденных телят при условии их содержания раздельно от больных коров. Антитела вырабатываются преимущественно на структурный белок gp51 и относятся к IgC, IgA и IgM. Наличие AT не предотвращает развития опухолей.

     Культивирование. Вирус лейкоза впервые удалось обнаружить в краткосрочных культурах лимфоцитов крови инфицированных животных. ВЛКРС репродуцируется в перевиваемых хронически инфицированных культурах клеток тканей животных разных видов. Наибольшее распространение в мире получила перевиваемая линия клеток FLK-BLV, которую получил в 1974 г. Van der Maaten путём культивирования эмбриональных клеток почки овцы с лимфоцитами лейкозной коровы. Эта линия клеток используется для биохимических, морфологических и серологических исследований.

     В настоящее время получены и широко используются перевиваемые хронически инфицированные ВЛКРС линии клеток: фибробласты легкого эмбриона коровы (АИД-15), почки эмбриона коровы (ПЭК); почки эмбриона овцы (FLK-BLV); легкого эмбриона летучей мыши (T61-Lu); легкого макаки-резус (BLV-Simian); селезенки овцы (FLS, J-1228); тимуса эмбриона коровы (ТЭК-МВА-766 LmTT).

  Способность ВЛКРС индуцировать в монослойных куътурах клеток образование синцитиев (многоядерных клеток) была использована для разработки специфичного, чувствительного и быстрого диагностического теста для вьывления инфекционного вируса и ВНА. Этот тест обеспечивает количественные результаты и успешно применяется для прямого выявления ВЛКРС - инфекции у КРС и животных других видов.

     ГА  свойства. ВЛКРС агглютинирует только эритроциты мышей. Максимальная ГА наблюдается при рН 6 и температуре 4°С. После обработки вируса тритоном Х100 или ультразвуком ГА активность вируса повышается в 6-16 раз. Обработка трипсином, KI04 или нейраминидазой значительно снижает ГА-активность ВЛКРС. Эти данные указывают на то, что ГА ВЛКРС является гликопротеином gp51, который после очистки обладает высокой ГА- J активностью. Обработка мышиных эритроцитов нейраминидазой в 4 раза повышает их способность агглютинироваться.

     Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больные лейкозом животные. В естественных условиях инфекция ВЛКРС может передаваться пренатально и постнатально. Механизм пренатальной передачи включает передачу вирусного генома через гаметы (генетическая и хромосомная трансмиссия) и передачу целого вируса (эпигенетическая или экстрахромосомная трансмиссия). Постнатальная передача включает передачу вируса через молоко или при контакте. Контактная передача может быть результатом прямого воздействия контаминированных вирусом секретов или экскретов или переноса вируса, насекомыми или контаминированными объектами. ВЛКРС может персистировать в лейкоцитах клещей и переноситься ими на здоровых животных. Пренатальная передача ВЛКРС не превышает 20 случаев. Вирус передается от матери плоду трансплацентарно, во время последних 6 мес. внутриутробной жизни, а не через половые клетки.

     Однако  основным путем распространения инфекции в естественных условиях является контактная передача. Так как частицы ВЛКРС не продуцируются in vivo, то логично предположить, что в большинстве случаев вирус передается с инфицированными лимфоцитами. Для заражения коровы достаточно ввести внутрикожно 2500 лимфоцитов крови. Учитывая возможность переноса ВЛКРС ничтожным количеством крови, следует иметь в виду, что при не соблюдении элементарных санитарных правил инфекция может распространяться во время выполнения ветеринарных процедур со шприцами, иглами и другими хирургическими инструментами, контаминированными кровью. Следовательно, при массовом взятии крови, вакцинации, туберкулинизации и других мероприятиях для каждого животного необходимо использовать отдельный стерильный инструмент. Несоблюдение этого правила резко повышает инфицированность животных неблагополучных хозяйств. Имеются косвенные доказательства того, что распространение инфекции ВЛКРС может осуществляться насекомыми. В тропических зонах, например в Венесуэле, где распространены кровососущие насекомые, пораженность лейкозом особенно высока.

     ВЛКРС или инфицированные им лимфоциты  присутствуют в молоке большинства  инфицированных животных. Однако, несмотря на то, что молоко и молозиво инфицированных коров содержат вирус, инфекция новорожденным телятам в естественных условиях передается редко по сравнению с контактным заражением. Устойчивость телят, вскормленных инфицированными коровами, к ВЛКРС в течение первых месяцев жизни обусловлена, вероятно, материнскими ВНА, которые приобретают все телята, получающие молозиво. Если теленок заражен ВЛКРС во внутриутробный период, то колостральные AT не влияют на персистенцию вируса. В зависимости от уровня AT в молозиве, материнские AT исчезают в течение 4-6 мес. после рождения. Внутриутробная передача вируса лейкоза обнаружена у 4 из 50 обследованных новорожденных телят. По мнению авторов, возникновение передачи вируса лейкоза не оказывает существенного влияния на эпизоотологию данной инфекции, чем обосновывают нецелесообразность использования серопозитивных коров в системе противолейкозных мероприятий.

     В сперме инфицированных быков ВЛКРС не выявлен. Однако, у быков с воспалением генитального тракта могут быть в сперме лимфоциты, инфицированные ВЛКРС. Экспериментально установлено, что коров можно инфицировать путем нанесения таких лимфоцитов на слизистую оболочку матки. Таким образом, в случае наличия ВЛКРС в сперме инфицированных быков исключена передача вируса от быка корове. Вместе с тем, различий в частоте проявления инфекции среди потомства ВЛКРС положительных и ВЛ КРС отрицательных быков не выявлено. Механизм контактной передачи ВЛКРС не ясен, поскольку не установлено наличие вируса в фекалиях, моче и слюне инфицированных животных. Парентеральное введение подопытным животным слюны, выделений из носа, проб выдыхаемого воздуха и мочи инфицированных животных не вызывало депрессии. Исследованиями, проведенными в динамике опыта, было установлено, что через 60 сут. после прекращения выпаивания молока у 2-х кроликов в сыворотке крови были выявлены антитела к ВЛКРС в РИД, а через 90 сут. еще 5 кроликов были серопозитивными. На морских свинках не удалось установить факт передачи ВЛКРС через молоко. Опытные животные, которым выпаивали молоко, термически обработанное и контрольные были серонегативными на протяжении всего срока наблюдения. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что молоко является фактором передачи ВЛКРС. В основном инфекционный процесс у КРС ограничивается 2-мя стадиями: инкубационной и бессимптомного вирусоносительства. Только у небольшого процента 5-7 взрослых животных устанавливают 3-ю и 4-ю стадии: клинико-гематологическое и опухолевое проявление, характерные для лейкоза.