Амилолитические ферменты

Очистка ферментов способствовала также более глубокому пониманию их высокой специфичности, являющейся одним из наиболее характерных и важных свойств ферментов. Это свойство резко отличает ферменты от других катализаторов. Благодаря специфичности возможно существование полиферментных систем, осуществляющих цепи реакций, из которых состоят

различные обменные процессы.

Значительные успехи были достигнуты в области изучения свойств и функций ферментов. Однако в этой области предстоит еще очень большая работа: много важных ферментов еще только предстоит открыть; другие, на существование которых мы уже имеем указания, в настоящее время ожидают изучения.

Мы считаем, что в настоящее время энзимология достигла той стадии, когда в ближайшем будущем можно надеяться пожать обильные плоды всего громадного числа исследований, которые были проведены в последние годы. Особенно большие успехи достигнуты при изучении одной из самых увлекательных проблем энзимологии — механизма действия ферментов.

Наконец, никогда не следует забывать, что ферменты имеют столь большое значение вследствие того, что сама жизнь тесно связана с ферментным катализом. По необходимости развитие энзимологии происходило главным образом в направлении изучения изолированных ферментов. Только в последние годы появились возможности для развития биологической стороны предмета, а именно для изучения ферментов и ферментных систем непосредственно в живой клетке.

2. ОБЩАЯ ЧАСТЬ

2.1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ЭНЗИМОЛОГИИ

2.1.1. Понятие о ферментах как о биологических катализаторах.

Ферменты (лат. Fermentum – брожение, бродильное начало) – это специфические белки, способные во много раз ускорять биохимические реакции, протекающие в живых организмах, не входя при этом в состав конечных продуктов реакции. Т.е. ферменты (или другое их название – энзимы) являются биологическими катализаторами биохимических реакций.

Все биохимические реакции, протекающие в клетках микроорганизмов, в растительных и животных организмах, катализируются соответствующими ферментами. Переваривание, всасывание и усвоение пищевых веществ, синтез и распад белков, нуклеиновых кислот, жиров, углеводов и других соединений в тканях и клетках любого организма представляет собой совокупность ферментативных реакций. Любое функциональное проявление живого организма (дыхание, размножение и др.) обеспечивается действием соответствующих ферментных систем.

Ферменты обладают определенными свойствами, отличающих их от неорганических катализаторов: высокой субстратной специфичностью, высокой скоростью проведения ферментативной реакции, способностью ускорять реакции в физиологических условиях, т.е в условиях, характерных для жизнедеятельности клеток (соответствующая температура, реакция среды и др.)

2.1.2. Классификация и номенклатура ферментов.

В настоящее время число различных известных реакций, катализируемых ферментами, составляет более 2 тыс. и число их непрерывно возрастает. Для того, чтобы ориентироваться в этом множестве биохимических превращений, нужна некоторая систематика. Она создана Международным союзом по биохимии (International Union of Biochemistry, IUB) и рекомендована к повсеместному использованию. Согласно этой классификации все ферменты подразделяют на 6 классов в зависимости от типа катализируемых превращений:

1.Оксидоредуктазы. К этому классу ферментов относятся практически все ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.

2.Трансферазы. К этому классу относятся ферменты, катализирующие различные превращения, представляющие собой перенос радикала от молекулы-донора к молекуле-акцептору и не являющиеся процессом гидролиза. В общем виде эти превращения можно записать так:

XY + Z X + YZ   (X, Z H2O или OH-)

3. Гидролазы – ферменты, катализирующие разнообразные реакции гидролиза. Подклассы в этом классе выделяют в соответствии с типом гидролизуемых связей.

4. Лиазы. Ферменты этого класса катализируют в одном направлении гидролитическое расщепление субстрата с образованием кратной связи или, реже, цикла, а в другом направлении – присоединение по кратной связи.

5. Изомеразы – это ферменты, катализирующие различные процессы изомеризации.

6.Лигазы (синтетазы). Этот класс составляют ферменты, катализирующие реакции конденсации или присоединения, сопряженные с гидролизом одной из пирофосфатных связей в молекуле АТФ или ГТФ.

2.1.3. Химическая природа и строение ферментов.

Все ферменты – белки, имеющие, как и другие белки, первичную, вторичную, третичную и часто четвертичную структуру.

Ферменты могут быть как простыми, так и сложными белками. Молекулы ферментов, представляющие собой простые белки, целиком построены из полипептидных цепей и при гидролизе распадаются только на аминокислоты. Примером ферментов такого рода являются гидролитические ферменты пепсин, трипсин, уреаза, лизоцим и др. Большинство природных ферментов относится к сложным белкам, содержащих в составе своей молекулы помимо полипептидных цепей небелковый компонент. Как белковая часть такого сложного фермента (апофермента), так и небелковый компонент его молекулы (кофермент) в отдельности лишены ферментативной активности. Только соединившись вместе и образовав так называемый холофермент (полный фермент), они приобретают свойства, характерные для биокатализаторов. В роли коферментов могут выступать различные соединения. Так, ряд коферментов является производными витаминов. По химическому строению многие коферменты представляют собой нуклеотиды, некоторые – органические производные фосфорной кислоты или пептиды и их производные (например, фолиевая кислота, глутатион, КоА). Таким образом, между ферментами, нуклеотидами и витаминами существует определенная функциональная связь.

2.1.4. Механизм действия ферментов и их специфичность.

Для объяснения механизма действия ферментов было предложено много теорий. Все они исходят из экспериментально установленного факта, что биокатализаторы, так же как и неорганические катализаторы, не могут сделать возможным протекание процессов или реакций, которые с точки зрения термодинамики невозможны. Все теории катализа допускают, что катализаторы тем или иным путем снижают энергию активации катализируемой реакции и таким образом резко увеличивают скорость химического превращения.  Катализаторы  лишь  сокращают  время, необходимое для достижения  химической  реакцией  состояния  подвижного

равновесия. Состояние подвижного равновесия обратимой химической реакции в присутствии катализатора становится стационарным. Следовательно, при наличии катализатора в равной мере возрастает скорость как прямой, так и обратной реакции.

              Начало современным представлениям о механизме действия ферментов было положено работой Михаэлиса и Ментен, опубликованной в 1913 г. В этой работе впервые высказывалась идея о том, что основой действия ферментов является образование фермент-субстратного комплекса, который затем распадается с образованием продуктов ферментативной реакции и освобождением фермента в исходном состоянии.

              В процессе образования и превращениях фермент-субстратных  комплексов принято различать несколько стадий:

              1. Присоединение молекулы субстрата к ферменту.

              2. Последовательное превращение первичного фермент-субстратного комплекса в один или несколько активированных комплексов.

              3. Отделение конечных продуктов реакции от фермента.

              Специфичность, которую проявляют ферменты в отношении субстрата как при образовании фермент-субстратного комплекса, так и при каталитическом химическом превращении, обусловлена существованием в молекуле фермента специфического участка, называемого активным центром. Та часть активного центра, которая принимает непосредственное участие в каталитическом действии, получила название каталитического участка, а место, где осуществляется связывание фермента с субстратом, - контактного участка, или контактной площадки.

              К 80-м гг. 20 в. был идентифицирован аминокислотный состав активных центров многих ферментов. В активный центр фермента могут входить аминокислотные остатки, сравнительно далеко отстоящие друг от друга в полипептидной цепи и сблизившиеся в результате ее ”перекручивания” при образовании вторичной и третичной структур ферментного белка. Так, в молекуле химотрипсина (протеолитического фермента животного происхождения) в состав активного центра входят остаток гистидина, находящийся в полипептидной цепи в положении 57, остаток серина в положении 195 и остаток аспарагиновой кислоты  в положении 102.

              Расположение аминокислотных остатков, формирующих контактный участок в молекуле фермента, способствует такому пространственному размещению субстрата, которое наиболее благоприятно для его атаки каталитическими (функциональными) группами активного центра. Например, реакция А + В АВ, катализируемая соединениями, имеющие активные группы С, D и Е, в обычных условиях должна была бы происходить только в том случае, если бы одновременно столкнулись все пять реагентов. Вероятность такого столкновения ничтожно мала, поэтому скорость образования продукта реакции АВ в этом случае практически равна нулю. В  том  случае,  когда  эту  реакцию  катализирует  фермент,  требуется

только его взаимодействие с веществами А и В, поскольку группы  С, D и Е уже включены в состав молекулы фермента. В результате эффекта близости реакционных групп в молекуле скорость катализируемой ферментом реакции увеличивается на несколько порядков. Кроме того, когда субстрат присоединяется к активному центру фермента, пространственная конфигурация молекулы субстрата изменяется и определенные химические связи в ней ослабевают.

              Каталитическая активность фермента определяется структурой его молекулы в целом. Другие аминокислотные остатки, помимо входящих в активный центр, необходимы для формирования и стабилизации определенной конформации активного центра. Они также образуют участки, с которыми специфически взаимодействуют различные вещества, регулирующие активность фермента. В молекуле фермента имеются такие участки, за счет которых он может взаимодействовать с другими ферментами (при образовании мультиферментных комплексов) или белками мембран (мембранные ферменты).

              Важнейшим свойством ферментов является их субстратная специфичность, т.е. способность не только ускорять реакции, но и избирательно катализировать лишь определенный путь превращения конкретного вещества – субстрата.  По признаку специфичности действия все ферменты можно разделить на две группы:

1.      Ферменты, обладающие абсолютной специфичностью.

2.      Ферменты, обладающие относительной  специфичностью.

Абсолютная специфичность проявляется тогда, когда фермент действует лишь на одно единственное вещество и катализирует только определенное превращение этого вещества. К абсолютной специфичности относят также стереохимическую (оптическую) специфичность. В живой природе встречаются лишь определенные пространственные формы соединений: аминокислоты в белках – только L-ряда, сахара – преимущественно D-ряда. Ферменты всегда действуют только на один из двух оптических изомеров вещества (L- или D-изомер). Специфичность ферментов может быть направлена и на другие типы стереоизомеров. Так, ферменты, действующие на транс-изомер, обычно неактивны в отношении цис-изомера того же вещества.

Наряду с ферментами, которым свойственна абсолютная специфичность, имеется большая группа ферментов, обладающих относительной или групповой специфичностью. Например, пепсин (протеолитический фермент животного происхождения) катализирует расщепление белковых молекул, которые могут существенно различаться друг от друга как по аминокислотному составу, так и по физико-химическим

свойствам. Объясняется это тем, что местом действия пепсина является пептидная связь – CO – NH – .

2.1.5. Кинетика ферментативных реакций.

Скорость ферментативной реакции зависит прежде всего от природы фермента, который может обладать низкой или высокой ферментативной активностью, а также от концентрации субстрата, величины рН среды, температуры, присутствия ингибиторов или активаторов и др.

Установлено, что при прочих равных условиях и при наличии избытка субстрата начальная скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента.

Зависимость между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции графически можно выразить кривой, показанной на

рисунке 2.1.

Рис. 2.1. График, выражающий зависимость между скоростью ферментативной реакции (V) и концентрацией субстрата (S) при постоянной концентрации фермента: отрезок абсциссы Км соответствует константе Михаэлиса (концентрация субстрата, при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной – Vмакс).

              Скорость реакции, соответствующая восходящей части кривой, пропорциональна концентрации субстрата (S); в верхней части кривой скорость реакции приближается к максимальному значению (Vмакс) и почти не зависит от концентрации субстрата.

              Исходя   из   представлений   об   образовании   фермент-субстратных

комплексов в ходе ферментативной  реакции Михаэлис и Ментен рассчитали весьма важную константу, позже названную константой Михаэлиса (Км), которая в числовом выражении равна той концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость реакции составляет половину максимальной (т.е. когда в любой момент в комплексе с субстратом находится и половина молекул фермента).  Таким образом, Км является мерой сродства между ферментом и субстратом, причем низкие величины Км свидетельствуют о высокой степени такого сродства.

              Существует еще одна величина, характеризующая ферментативную реакцию, которая получила название ”число оборотов фермента”. Величина это показывает, сколько молекул субстрата превращается в продукты реакции за единицу времени в расчете на одну молекулу фермента.