Амилолитические ферменты

Манометрические методы. Эти методы используются при определении активности фермента в тех случаях, когда в исследуемых реакциях один из компонентов находится в газообразном состоянии. К таким реакциям относится главным образом те, которые связаны с процессами окисления и декарбоксилирования, сопровождающимися поглощением или выделением кислорода и углекислоты, а также реакции, в которых выделение или связывание газа происходит в результате взаимодействия продуктов ферментативного превращения с добавленным в систему реактивом. Наблюдение за ходом реакции во времени проводится в специальных приборах - манометрических аппаратах Варбурга.

Другие методы. Сюда относится обширный ряд методов, включающих поляриметрию, вискозиметрию и кондуктометрические измерения и т.п. Также определение активности можно выполнять, используя методы хроматографии и электрофореза на бумаге. Эти методы высокочувствительны и специфичны, что делает их во многих случаях незаменимыми; они позволяют значительно сократить расход фермента на измерение активности, но не всегда применимы ввиду продолжительности разделения веществ в процессе хроматографии (и электрофореза).

2.1.11. Получение ферментных препаратов.

        Для получения ферментных препаратов используют как микроскопические грибы, так и бактерии и дрожжи. Иногда получение технического ферментного препарата кончается проведением процесса ферментации, например, в спиртовой промышленности для осахаривания крахмала используют жидкую культуру Aspergillus niger. Впоследствии ее добавляют в жидком виде в количестве 10-12% к осахареваемому затору. Однако активность ферментов в культуральной жидкости быстро снижается. Поэтому широко практикуют получение сухих технических ферментных препаратов.

Технические препараты ферментов. Комплексный амилолитический ферментный препарат получают путем выращивания плесневых грибов на твердой питательной среде с последующей сушкой и измельчением полученной массы. Более активный препарат фермента получают путем экстракции такого “грибного солода” с последующим выпариванием и сушкой. Еще более активные ферментные препараты можно выделить из культуральной жидкости путем осаждения амилазы ацетоном и дальнейшим высушиванием коагулятом при температуре 27-270С. Для осаждения фермента часто используют и сульфат аммония. Предварительно культуральную жидкость выпаривают при температуре 400 С до 40%-ного содержания сухих веществ. Коагулят сушат вместе с наполнителем.

Комплекс ферментов протеолитического и амилолитического действия получают при помощи культуры Bacillus subtilis. Это аэробные, грамположительные, подвижные палочки. Для этих бактерий характерен очень богатый комплекс гидролитических ферментов. В качестве источников питания они могут использовать белки, углеводы, спирты, органические кислоты. Bacillus subtilis культивируют как методом поверхностного культивирования на отрубях, так и в жидких средах особого состава по методу глубинного культивирования.

Целлюлолитические ферментные препараты. Производство целлюлаз основывается на использовании культуры гриба Trichoderma viride. Существующие в настоящее время способы получения целлюлаз в глубинной культуре предполагает выращивание микроорганизмов-продуцентов целлюлаз на питательной среде, содержащей в качестве источников углерода, как правило, очищенную целлюлозу, или же содержащие ее природные субстраты. Но получение целлюлазы с использованием в качестве основного компонента среды природной целлюлозы (например, древесные опилки) сопряжено с рядом технологических трудностей. Более рационально использование питательной среды, содержащей растворимый “индуктор”. Такой питательной средой может быть молочная сыворотка, основным компонентом которой является лактоза (предварительно от молочной сыворотки отделяют белок). В качестве продуцента может быть использован гриб Trichoderma lignorum, позволяющий получить весь комплекс целлюлолитических ферментов, необходимый для расщепления природных целлюлозусодержащих субстратов.

3.АМИЛОЛИТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

Амилолитические препараты широко выпускаются в нашей стране и за рубежом. В основном это крупнотоннажное производство. Амилазы нахо­дят применение почти во всех областях, где перерабатывается крахмалсо-держащее сырье. Амилазы используют для осахаривания зернового и кар­тофельного крахмала. Самым большим потребителем амилолитических ферментов является спиртовая и пивоваренная промышленности, где в на­стоящее время солод (проращенное зерно) успешно заменяется амилолити­ческими ферментными препаратами.

3.1. Источники получения амилаз

Амилазы очень широко распространены в природе. Они синтезируются многими микроорганизмами (бактерии, грибы, актиномицеты, дрожжи), животными и растениями. До развития ферментной промышленности глав­ным промышленным источником получения амилаз в европейских странах было проросшее зерно (солод). Для медицинских целей амилазы получали из животного сырья. В настоящее время главным источником амилаз явля­ются микроорганизмы, особенно бактерии, грибы и реже дрожжи.

3.2. Механизм действия и свойства амилаз

Субстратами для действия амилаз являются крахмал, состоящий из амило­зы и амилопектина, продукты частичного гидролиза крахмала и гликоген. Крахмал - растительный полисахарид с очень сложным строением. Это двухкомпонентное соединение, состоящее из 13-30% амилозы и 70-85% амилопектина. Оба компонента неоднородны, их молекулярная масса (М. м.) колеблется в широких пределах и зависит от природы крахмала. Амилоза - это неветвящийся полимер, в котором остатки глюкозы соеди­нены -1, 4-гликозидной связью; степень полимеризации около 2000. В «аномальных» амилозах с одной-двумя -1, 6-связями полимеризация мо­жет возрасти до 6000 (рис.1). Амило­за практически не об­ладает восстанавлива­ющей способностью, так как в каждой мо­лекуле амилозы име­ется только одна сво­бодная альдегидная группа.

Молекула амилозы представляет собой растянутую спираль, шаг которой составля­ет 10,6 А и в каждый виток входит 3 остатка глюкозы.  Максимальная длина молекулы амилозы достигает 7000 А. В растворе спираль сжимается за счет увеличения витка, в котором уже участвует 6 остатков глю­козы. При вхождении молекул йода в спираль амилозы возни­кает характерный синий цвет. Строго говорить о величине молекулы амилозы нельзя, т. е. даже из одного образца крахмала извлекается амило­за, с величиной молекулы от 500 до 2000 остатков глюкозы. Амилопектин имеет большую молекулярную массу, чем ами­лоза, и более сложное строе­ние. Это ветвящийся полиса­харид. Предполагается, ами­лопектин ветвится дихотоми­чески, т. е. число концевых звеньев всегда на единицу больше числа звеньев, дающих ветвление, а сумма этих чисел дает общее число звеньев по всей цепи (см. рис. 2.2).

Механизм действия. К группе амилотических ферментов относятся - и -амилазы, глюкоамилаза, пуллуланаза, изоамилаза и некоторые другие ферменты. Амилазы бывают двух типов: эндо- и экзоамилазы. Четко выра­женной эндоамилазой является а-амилаза, способная к разрыву внутримо­лекулярных связей в высокополимерных цепях субстрата.

Глюкоамилаза и -амилаза являются экзоамилазами, т. е. ферментами, атакующими субстрат с нередуцирующего конца.

При изучении механизма действия амилаз имеются определенные слож­ности, и прежде всего они заключаются в том, что субстрат - крахмал неод­нороден и имеет различные характеристики по степени полимеризации гли-козидной цепи и количеству ветвлений.

Реакции, катализируемые амилазами, имеют две стадии: короткую -предстационарную и длительную - стационарную. Во время первой стадии эндоамилаза быстро уменьшает молекулярную массу субстрата, образуя смесь линейных и разветвленных олигосахаридов. Второй этап реакции продолжается, пока продукты гидролиза не перестанут окрашиваться йо­дом; он протекает значительно медленнее и зависит от индивидуальных свойств фермента и его природы. Поэтому конечные продукты гидролиза а-амилазами могут быть различными. Первая стадия воздействия фермента на субстрат хотя и носит неупорядоченный характер, имеет для всех видов -амилаз схожий механизм.

Существует две гипотезы о механизме действия экзоамилаз на субстрат. Первая гипотеза предполагает, что, воздействуя на субстрат по одноцепочечному или «молниеобразному» механизму, экзоамилаза образует фер­мент-субстратный комплекс с захватом нередуцирующего конца цепи.

Дальнейшее продвижение фер­мента по этой цепи происходит до полного ее гидролиза. По второй гипотезе (- и глюко­амилаза действуют на субстрат путем механизма множественной атаки, т. е. фермент образует комплекс с молекулой субстрата, затем через несколько этапов этот комплекс распадается и фер­мент связывается с новой моле­кулой субстрата. Иными слова­ми, при множественной атаке происходит нечто среднее между неупорядоченным механизмом и одноцепочечной, «молниеобразной» атакой. Для полного гидро­лиза по этому механизму однамолекула субстрата должна образовывать много раз фермент-субстратные комплексы. При этом возможен гидролиз нескольких связей в одном ката­литическом акте.

Механизм воздействия амилаз на субстрат может быть рассмотрен с не­скольких позиций: вид разрываемой связи (-1,4 или -1,6); тип воздействия на субстрат (эндо- или экзо-); влияние на скорость гидро­лиза степени полимеризации субстрата;

4) возможность гидролиза олиго­сахаридов;

способность фермента к множественной атаке субстрата.

Наличие признаков амилаз, отраженных в 3 и 4 позициях, при действии на линейные субстраты может свидетельствовать о существовании у этих ферментов подцентровой структуры. Вероятно, активный центр амилазы может состоять из нескольких  подцентров, каждый из которых может вступать в контакты с глюкозным остатком. Энергия взаимодействия (А;), выраженная в единицах свободной энергии (кДж/моль), определяет подцентровое сродство фермента к субстрату. Это сродство индивидуаль­но и может быть как положительным, так и отрицательным. Вероятность существования подцентровых структур амилаз помогает установить стро­ение активного центра амилаз, дает более четкое объяснение субстратной специфичности, но не дает объяснений механизма гидролиза разветвлен­ных субстратов.

-Амилаза. а-Амилаза (а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1.) яв­ляется эндоамилазой, вызывающей гидролитическое расщепление -1,4-гли-козидных связей внутри высокополимеризованного субстрата. Фермент на­зван -амилазой потому, что он высвобождает глюкозу в -мутамерной форме.

-Амилаза - водорастворимый белок, обладающий свойствами глобулина и имеющий М. м. 45 000-60 000. Своего рода исключением является -амилаза В. macerans, которая имеет М. м. 130 000. Есть указания, что некото­рые термостабильные -амилазы имеют М. м. 14 000-15 000, но в их моле­кулах содержится в 2-3 раза больше атомов кальция.

Все а-амилазы относятся к металлоэнзимам, содержание в них Са колеб­лется от 1 до 30 г атом на 1 г  моль фермента. Полное удаление кальция приводит к инактивации фермента. Повторное введение кальция в среду мо­жет частично восстановить его активность. -Амилаза В. subtilis с помощью иона цинка способна образовывать димерную форму, чего лишены другие -амилазы. Все -амилазы устойчивы к воздействию протеаз. Они богаты ти­розином и триптофаном. Глютаминовая и аспарагиновая кислоты составля­ют 25% массы белка. Наличие этих кислот в а-амилазе связывают с их оса-харивающей способностью. Так, разжижающие -амилазы не имеют сульфгидрильных групп, а осахаривающие содержат один остаток цистеина. Сравнительно мало или совсем отсутствуют в а-амилазах содержащие серу аминокислоты. Некоторые -амилазы грибного происхождения имеют уг­леводный фрагмент, в состав которого могут входить манноза, ксилоза, гексозоамин, но функции его не установлены.

В зависимости от вида микроорганизма свойства ос-амилаз могут сильно отличаться не только по механизму воздействия на субстрат и конечным продуктам, но и по оптимальным условиям для проявления максимальной активности.

Действуя на целое крахмальное зерно, -амилаза атакует его, разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, т.е. как бы раскалывает зерно на части. Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием на окрашиваемые йодом продукты - в основном состоящие из низкомоле­кулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный. В результате воздействия -амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашивающиеся йо­дом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно гидролизуются -амилазой до ди- и моносахаридов.

Все -амилазы проявляют наименьшее сродство к гидролизу концевых связей в субстрате. Некоторые же а-амилазы, особенно грибного происхож­дения, на второй стадии процесса гидролизуют субстрат более глубоко с об­разованием небольшого количества мальтозы и глюкозы. Схему гидролиза под действием а-амилазы можно записать следующим образом:

                  а-Амилаза                                          

Крахмал,----------------> а-Декстрины + Мальтоза + Глюкоза

гликоген                          (много)            (мало)         (мало)

-Амилаза. -Амилаза (-1,4-глюкан мальтогидролаза, КФ 3.2.1.2) - активный белок, обладающий свойст­вами альбумина. Каталити­ческий центр фермента со­держит сульфгидрильные и карбоксильные группы и имидозольный цикл остат­ков гистидина. -Амилаза -экзофермент концевого дей­ствия, проявляющий срод­ство к предпоследней -1,4-связи с нередуцирующего конца линейного участка амилозы и амилопектина.

В отличие от -амилазы -амилаза практически не гидролизует нативный крахмал, тогда как клейстеризованный крахмал гидро­лизуется ею с образованием мальтозы -конфигурации, поэтому данная амилаза по аналогии с -амилазой на­зывается -амилазой. Если гидролизу подвергается амилоза, то гидролиз идет полностью до мальтозы. Не­значительное количество декстринов может образовы­ваться при гидролизе «ано­мальных»  амилоз, так как гидролиз -амилазой идет только по линейной цепи до -1,6-связей. Если субстратом для -амилазы служит амилопектин, то гидролиз идет в значительно меньшей степени. -Амилаза отщепляет фрагмент с не­редуцирующего конца участка от внешних линейных ветвей, имеющих по 20-26 глюкозных остатков, с образованием 10—12 молекул мальтозы. Гид­ролиз приостанавливается на предпоследней -1,4-связи, граничащей с -1,6-связью. В гидролизате накапливается 54-58% мальтозы, остальное составляют высокомолекулярные декстрины, содержащие значи­тельное количество а-1,6-связей - так называемые -декстрины. Действие -амилазы на крахмал можно записать в виде следующей схемы: