Амилолитические ферменты

                 -Амилаза

Крахмал,----------------> Мальтоза + р-Декстрин

гликоген                     (54-58%)       (42-46%)

-Амилазы проявляют большую стабильность в отсутствие ионов Са2+.

Молекулярная масса -амилазы растений достаточно высока, она составля­ет от 50 000 до 200 000. Фермент может состоять из одной или четырех субъединиц до 50 000 каж­дая. Фермент содержит SH-группы и чувствителен к действию тяжелых метал­лов. Считается, что (-ами-лаза обладает высокой спо­собностью к множествен­ной атаке субстрата. Для амилозы средней молеку­лярной массы в одном при­соединении фермента к суб­страту возможно отщепле­ние до четырех остатков мальтозы. При увеличении молекулярной массы суб­страта возможно и большее количество мест атаки.

Глюкоамилаза. Глюкоамилаза (а-1,4-глюкан глюкогидролаза, КФ 3.2.1.3.) широко распространена в природе. Она синтезируется многими ми­кроорганизмами и образуется в животных тканях, особенно в печени, почках, плаценте кишечника и т. д. Фермент в литературе известен под различ­ными названиями: амилоглюкозидаза, -амилаза, лизосомальная -глюкозидаза, кислая мальтаза, матулаза и экзо-1,4--глюкозидаза. Глюкоамилаза катализирует последовательное отщепление концевых остатков -D-глюкозы с нередуцирующих концов субстрата. Это фермент с экзогенным механизмом воздействия на субстрат. Многие глюкоамилазы обладают способностью так же быстро, как и -1,4-связь, гидролизовать -1,6-глюкозидные связи. Но это происходит только в том случае, когда за -1,6-связью следует -1,4-связь, поэтому декстран ими не гидролизуется. От­личительной особенностью глюкоамилаз является способность в десятки раз быстрее гидролизовать высокополимеризованный субстрат, чем олиго- и дисахариды.

              В литературе высказывается мнение, что ме­ханизм атаки субстрата глюкоамилазой может быть двух типов: либо одноцепочечный, либо множественной атаки, и что активный центр имеет подцентровую структуру.

Почти все глюкоамилазы являются гликопротеидами, содержащими от 5 до 35% углеводов, которые состоят из олиго-, ди- и моносахаридов. Угле­водный компонент может быть целостным фрагментом или же разбитым на индивидуальные соединения, которые прикрепляются к белку через трео­нин и серин. Например, у глюкоамилазы A. niger их 20. Большинство из­вестных глюкоамилаз имеет оптимум рН при 4,5-5,2, реже - при 5,7-6,0, в основном для дрожжевых глюкоамилаз.

РН-стабильность микробных глюкоамилаз лежит в широком диапазоне -от 2,5 до 9. Термостабильность глюкоамилаз лежит в интервале от 30 до 45°С и редко повышается до 55-60°С. Глюкоамилазы различного происхо­ждения заметно отличаются по молекулярной массе, которая, по данным различных авторов, имеет значения от 48 000 до 210 000. Следует заме­тить, что далеко не все микробные глюкоамилазы способы полностью гид­ролизовать крахмал до глюкозы. Еще в 60-х годах И.Фукумото предложил все микробные глюкоамилазы разделить на два типа: полностью гидро­лизующие крахмал до глюкозы и гидролизующие крахмал до глюкозы на 80-85%.

В то время предполагалось, что степень гидролиза зависит только от свойств глюкоамилаз и их происхождения. Позже было показа­но, что при росте культуры параллельно накапливаются и другие амилоли­тические ферменты, обладающие не только гидролитическим, но и трансферазным действием. Это гликозилтрансфераза и -амилаза. Даже в слу­чае, если система открытая и продукт гидролиза (глюкоза) постоянно уда­ляется из системы, процесс может дойти до полного гидроли­за крахмала до глюкозы. Если же система закрытая и концентрация суб­страта велика, то при достижении определенной концентрации глюкозы в реакционной среде в результате переноса глюкозильных остатков на глю­козу, ди- и олигосахариды начинают накапливаться изомальтоза, паноза, нигероза, изомальтотриоза и другие сахара, которые имеют горький вкус. В результате процесс не может дойти до полного превращения крахмала в глюкозу и возникает ошибочное представление, что глюкоамилаза не пол­ностью гидролизует крахмал. Сама же глюкоамилаза может проявлять не­большую трансферазную активность, но только при концентрации глюко­зы свыше 60-70%. Поэтому ранее принятое деление глюкоамилаз на два типа следует считать необоснованным.

3.3. Компьютерное моделирование структуры амилолитических ферментов

Используя данные рентгеноструктурного анализа и программу MolScript, методом компьютерного моделирования построена трехмерная модель макромолекулы глюкоамилазы из Aspergillus awamori, что позволило по-новому оценить мно­го­численные экспериментальные данные, полученные клас­си­ческими методами (электронная спектроскопия, ЯМР, ИК спектроскопия и т.д.). Показаны особенности строения актив­ного центра данного фермента, обозначены функционально важ­ные группы. Внесены дополнения в представления о механизме катализа амилолитическими ферментами.

При изучении механизмов ферментативного катализа классическими методами (ИК и УФ- спектроскопия, электронная спектроскопия, ЯМР и т.д.) дополнительную информацию вносит компьютерное моделирование белковых молекул с использованием данных рентгеноструктурного анализа (РСА). Способность глобулярных белков образовывать качественные монокристаллы, в которых все атомы идентичны и ориентированы одинаковым образом, позволила изучать их с помощью метода кристаллографии. Известно, что данные рентгеноструктурного анализа всегда правильно отражают укладку белковой цепи, а в подавляющем большинстве случаев буквально воспроизводят активную конформацию фермента. Следовательно, они являются надежной и пока что единственной основой для количественного описания механизма каталитического акта на атомно-молекулярном уровне. Метод кристаллографии позволяет расшифровывать трехмерные структуры комплексов ферментов с ингибиторами, которые в той или иной мере соответствуют химическим стадиям катализа. Располагая рентгеноструктурными данными, одна часть которых отвечает реальному исходному состоянию фермента, а другая - фермент-ингибиторным комплексам, становится возможным воссоздание механизма каталитического акта, а, следовательно, можно проследить динамику поведения белковой макромолекулы. Разрабатываемые в настоящее время программы компьютерного моделирования белковых молекул на основе результатов кристаллографии позволяют получать наглядные трехмерные изображения исследуемых объектов, и по-новому осмыслить данные экспериментальных исследований кинетико-термодинамических свойств ряда ферментов, полученные за последнее десятилетие, а, следовательно, выявить дополнительные аспекты молекулярных механизмов ферментативного превращения субстрата. В этой связи целью данной работы является анализ топологии амилолитических ферментов с использованием программы MolScript по данных рентгеноструктурного анализа. Повышенный интерес к амилазам обусловлен

их широким применением в медицине, пищевой и легкой промышленности в

качестве эффективных биокатализаторов. Исследования физико-химических свойств, кинетико-термодинамических параметров, особенностей фермент-субстратных взаимодействий при осуществлении акта катализа амилолитическими ферментами способствовали существенному изменению и усовершенствованию многих существующих технологий и созданию новых. Однако, очевидным является недостаток информации о пространственной организации макромолекул ферментов данной группы.

Объектом наших экспериментальных исследований является глюкоамилаза из Aspergillus awamori, препарат Г-20Х производства Ладыжинского завода ферментных препаратов. Для определения активности глюкоамилазы использовали глюкозооксидазный метод. Определение общего количества белка в ферментном препарате проводили по методу Лоури. Исследование соотношения типов вторичной структуры осуществляли методом инфракрасной спектроскопии на спектрометре Specord M-80 (Германия). Определение молекулярной массы глюкоамилазы, а также изучение четвертичной структуры фермента с использованием додецилсульфата натрия в концентрации 3,5×10-5 моль/л для разрушения надмолекулярного уровня организации, проводили с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-200. Количественное определение SH-групп осуществляли методом, основанном на измерении прироста оптической плотности в области 255 нм при присоединении n-меркурибензоата к SH-группам. Для количественного определения S-S групп использовали метод, основанный на измерении оптической плотности (l=412нм.) при образовании нитротиобензоата. Определение числа ионогенных групп проводили на автоматической установке, разработанной на кафедре биофизики и биотехнологии ВГУ, путем сравнения кривых титрования белка. Изучение пространственной структуры глюкоамилазы осуществляли с использованием программы MolScript. 

Программа MolScript используется для моделирования протеиновых и протеидовых структур. Исходными данными для программы является *.in

файл, в котором указывается файл рентгеноструктурного анализа, объекты для вывода и точное  их описание с помощью графических параметров. Для создания в первом приближении входных файлов MolScript используется программа MolAuto. Эта программа распознает вторичную структуру в файле pdb и выводит соответствующие команды для схематического описания данной структуры. MolAuto имеет несколько ключей, позволяющих влиять на свойства объектов. Программа не способна выбирать удобный ракурс, поэтому пользователю необходимо выбирать его самостоятельно. MolAuto может быть частью потока UNIX  с программой MolScript: например для быстрого получения изображения структуры в режиме OpenGL. Каждый формат, поддерживаемый MolScript, обладает своими специфическими свойствами. Поэтому выбор формата производится с учетом установленного программного обеспечения и желаемого набора свойств полученной модели.

Программа MolScript использует одну фиксированную правостороннюю

систему координат с ценой деления 1 ангстрем. Точка обзора зафиксирована и измениться не может. Для просмотра молекулы с разных ракурсов атомные координаты необходимо трансформировать, т.е. повернуть и/или транслировать в пределах системы координат. Молекулярные координаты считываются из pdb файла, а сами координаты атомов и остатков, входящих в данный файл, используются графическими командами. Координаты выбранных атомов трансформируются матрицей, определенной одной или несколькими операциями.

При изучении топологии для двумерных статических и трехмерных моделей проводилось распознавание субъединиц ферментов в разных масштабах по различным направлениям. Топологические аспекты рассматривались как для фрагментов, так и для целостных молекул амилолитических ферментов, что позволило ввести обозначения функционально значимых групп.

Классические методы изучения особенностей протекания ферментативного катализа позволяют рассматривать широкий круг вопросов. Так, экспериментальным путем нами было исследовано влияние различных физико-химических факторов на конформацию макромолекулы глюкоамилазы из Aspergillus awamori и связанных с ней механизмов активации и инактивации данного фермента; изучены кинетико-термодинамические аспекты реакции гидролиза крахмала. Методом гель-хроматографии определена молекулярная масса глюкоамилазы, составляющая 106 кДа. Исследование аминокислотного состава глюкоамилазы показало, что молекула фермента содержит 26,8% аминокислотных остатков с алкильными боковыми цепями (Ala, Val, Leu, Met, Ile), определяющими высокую устойчивость фермента к органическим растворителям. Обнаружено высокое содержание в молекуле глюкоамилазы Ser и Thr. Результаты наших экспериментов и анализ данных литературы по секвенированию глюкоамилазы (А.Е. Алешин и др.,1994) позволяют сделать

заключение о том, что молекула фермента имеет 6 SH-групп и 4 дисульфидных связи, стабилизирующих его третичную структуру. Изучение надмолекулярного уровня организации глюкоамилазы показало наличие четвертичной структуры, представленной двумя идентичными субъединицами с молекулярной массой 53600Да, обладающими каталитической активностью. Ее стабильность определяется водородными связями и гидрофобными взаимодействиями и может зависеть от небольших изменений в пространственной структуре каждой из взаимодействующих субъединиц. Причем четвертичная структура, по-видимому, обладает способностью передачи структурных перестроек от одной субъединицы к другой и является одним из факторов регуляции функциональной активности молекулы белка.

Рис. 1. Пространственная структура глюкоамилазы

Результаты исследований влияния n-меркурибензоата на каталитическую активность глюкоамилазы позволяют сделать заключение о том, что в состав активного центра данного фермента не входят имидазольная группа гистидина и SH-группы, а в гидролизе крахмала принимают участие карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Используя данные рентгеноструктурного анализа и программу MolScript, методом молекулярного моделирования показано, что активный центр глюкоамилазы расположен в сквозной полости (~ 1,5нм), ограниченной следующими аминокислотными остатками: Leu-58, Leu-130, Leu-177, Leu-319, Trp-178, Trp-417, Phe-187 (рис1).

Установлено, что в гидролизе крахмала принимают участие карбоксильные группы Asp-55, Glu-179, Glu-400 (рис.2).

Активный центр фермента располагается в щели, прикрытой двумя кластерами молекул H2O: первый - в области Leu-58 (12 молекул H2O), второй – в углублении активного центра (7 молекул). Показано, что с одной стороны щели активного центра сосредоточены Asp-55 и Glu-179, а с противоположной – Glu-400.

Результаты рентгеноструктурного анализа (Алешин А.Е. и др, 1994 [10]) показали, что поверхность молекулы глюкоамилазы гликозилирована: 10 аминокислотных остатков серина и треонина имеют маннозу (Ser-453, Ser-455, Ser-459, Thr-457 и др.).

Данный фермент характеризуется наличием N-терминального домена, состоящего из 440 аминокислотных остатков, O-гликозилированного участка, имеющего 70 аминокислот и C-терминального крахмалсвязывающего домена (100 аминокислот). Каталитический домен имеет 2 N-гликозилированных участка, причем контакт между N-гликозилированными цепями и полипептидом стабилизируется остатком маннозы с помощью водородной связи или ионизированными молекулами воды, чем и определяется стабильность фермента и возможность образования надмолекулярных структур. O-гликозилированный домен имеет остатки Gly перед и после C-конца, которые представляют собой изгибы, определяющие взаимодействие крахмалсвязывающего домена с каталитическим и соответствующую ориентацию молекулы субстрата. Гликозилирование предотвращает скопление молекул субстрата в связывающих центрах и обеспечивает стехиометрическое связывание.

Рис. 2. Пространственная структура макромолекулы глюкоамилазы

Методом компьютерного моделирования установлено, что для молекул глюкоамилазы характерна плотная упаковка гидрофобного ядра в виде 13 α-спиральных участков (рис.3), а так же антипараллельных β-структур, образующих 11 петель (рис.4).