Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comanonas и Pseudomonas - деструкторов n-толуолсульфона

На рис. 15 изображена зависимость ответов сенсора от величины рН, которая показывает, что оптимальным для функционирования клеток являлось значение рН 7.4. Температурная зависимость сенсора показана на рис. 15. Максимальные значения аналитических сигналов были получены при температуре 35°С.

 

Рис. 15. Зависимость величины ответа сенсора на основе иммобилизованных клеток плазмидсодержащего варианта штамма 32-I от величины рН. Среда измерения – калий-фосфатный буфер 30 мМ. Концентрация фенола – 25 мкМ.

Рис. 16. Кривая зависимости величины сигнала сенсора от температуры.

 

Полученные данные по рН и температурному оптимуму для микроорганизмов позволяют произвести сравнение с аналогичными параметрами для ферментов, проявляющих фенолоксидазную активность Так, известно, что для b-тирозиназы оптимальными является рН 9.0 и температура 30^оС, для фенол-2-монооксигеназы – рН 7.6 и температура 22^оС, для полифенолоксидазы – рН 7.0 и температура 25^оС, для лакказы – рН 7.0 и температура 37^оС [207]. Таким образом, можно допустить, что для штамма 32 - I характерна лакказная активность.

Стабильность сигналов сенсора изображена на рис. 16. Время жизни составляло 30 часов. Стабильные ответы (без потери активности) наблюдали на протяжении 8 часов, что несколько меньше, чем у описанных в литературе сенсоров. В частности, для сенсора на основе Rhodococcus [165] время жизни составляло 21 день, время жизни сенсора на основе P. putida DSM-548, описанного в работе [142], также составляло 21 день.

 

Рис. 17. Кривая стабильности сенсора на основе плазмидсодержащего варианта штамма 32-I. В качестве контрольного был использован раствор фенола в концентрации 25 мкМ.

 

Причиной малого времени  жизни сенсора предположительно могли быть два фактора: вымывание  клеток из носителя и их инактивация  или гибель. С целью проверки предположения о возможности вымывания клеток из состава биорецептора было проведено исследование стабильности сенсора при иммобилизации клеток в агаровый гель, поскольку включение в гель обеспечивает более прочное закрепление клеток, чем адсорбция. Кроме того, известно, что при микробной деградации токсичных соединений иммобилизация в агаровый гель оказывает защитное действие на клетки микроорганизмов [148]. В нашем случае стабильность клеток, иммобилизованных в агаровый гель, была сравнима со стабильностью клеток, адсорбированных на бумаге. Следовательно, возможной причиной малого времени жизни сенсора является снижение ферментативной активности клеток или их гибель. Нашли, что активность сенсора снижалась пропорционально по отношению ко всем веществам, что позволяет сделать вывод об инактивации клеток в целом, а не ферментных систем, отвечающих за окисление фенола. Можно предположить, что иные методы иммобилизации, позволяющие обеспечить оптимальные условия для клеток, приведут к увеличению стабильности сенсора.

Поскольку чувствительность сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного варианта штамма 32-I ко всем веществам, кроме фенола и катехола, была примерно одинакова, мы предположили, что в данной ситуации имеется возможность использования пары сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штамма в качестве основы для дифференциальной детекции фенола в средах сложного состава. В этом случае разность сигналов сенсоров позволит получить более точную оценку содержания фенола в средах сложного состава.

4.4. Возможные пути решения практических задач с применением биосенсорного подхода

Применение созданных  лабораторных макетов биосенсоров  на основе штамма-деструктора ТС и  штамма 32-I для анализа сточных вод нефтеперерабатывающего производства (г. Лисичанск, предприятие Лисичанскнефтеоргсинтез) показало, что специфические сигналы сенсора отсутствуют и основным эффектом при контакте сенсора со стоками является ингибирование клеточного дыхания. Наблюдаемый эффект объяснили присутствием токсичных компонентов стоков. На основе лабораторных анализов по основным компонентам стоков можно предположить, что ингибирование было обусловлено присутствием значительного количества токсичной органики (химическое потребление кислорода -ХПК - 300 мг/л и более) и сульфидов (более 20 мг/л). Это послужило основанием для выполнения серии тестов, основанных на полученном ранее опыте по изучению деградации ТС в колоночном реакторе, содержащем C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и направленном на исследование возможности использования для определения токсичных соединений в сточных водах микроорганизмов активного ила, применяемых при их очистке. В данном случае в колоночном реакторе вместо бактериальных клеток применили активный ил водоочистных сооружений нефтеперерабатывающего производства, который, по сути, является более адаптированным биоматериалом для подобных анализов. Был также сформирован сенсор для детекции фенола с использованием активного ила в качестве рецепторного элемента. Сенсор обладал широчайшей субстратной специфичностью и характеризовался почти полным отсутствием избирательности. Только при введении нитроароматических соединений (2, 4-ДНФ, пикриновая кислота, мочевина) наблюдались несколько более высокие амплитуды сигналов сенсора. Для всех остальных тестированных веществ (спирты, сахара, органические кислоты) амплитуды сигналов сенсора были практически одинаковыми. Для сенсора была построена калибровочная зависимость по фенолу с использованием стандартных растворов (рис. 18). Нижний предел детекции составил 5 мкМ (как и для сенсора на основе штамма 32-I), наибольшая амплитуда сигналов наблюдалась при концентрации фенола 200 мкМ. При наличии высоких концентраций фенола наблюдался эффект субстратного ингибирования.

Рис. 18. Калибровочная зависимость сенсора на основе активного ила БХО для фенола.

 

4.4.1. Деградация  целевых соединений сточных вод  иммобилизованными на колонке микроорганизмами установки биохимочистки сточных вод (БХО)

Одним из основных направлений  направления современной биотехнологии является очистка промышленных сточных вод с помощью микроорганизмов. При этом важно подобрать микроорганизмы, обладающие требуемыми деградативными активностями. Один из наиболее распространенных методов очистки сточных вод с помощью микроорганизмов – очистка с помощью активного ила в аэробных условиях.

В частности, стандартная  технологическая схема установки  биохимочистки промышленных стоков включает в себя аэротенки, в которых происходит окисление целевых соединений с помощью микроорганизмов активного ила, и вторичные отстойники, в которых иловая смесь, состоящая из входящего стока и микроорганизмов активного ила, отстаивается, после чего очищенный сток идет на выход установки, а активный ил возвращается в систему. Принципиальная схема установки биохимочистки промышленных стоков нефтеперерабатывающего завода представлена на рис. 19.

Рис. 19. Принципиальная схема установки биохимической очистки стоков нефтеперерабатывающего завода.

 

При работе установки  биохимочистки должен проводиться  постоянный контроль процесса очистки сточной воды. Кроме того, необходимо периодически производить отладку работы установки с целью оптимизации происходящих на ней процессов.

Для контроля и оптимизации  работы установки биохимической  очистки может быть успешно применен биосенсорный подход.

Так, одним из недостаточно решенных вопросов является контроль общего состояния активного ила, его деградирующей активности.

В рамках работы было проведено  исследование деградирующей активности микроорганизмов, входящих в состав биоценоза активного ила установки биохимочистки стоков нефтеперерабатывающего завода.

Для этого был сконструирован аналог колоночного биосенсора, в  котором микроорганизмы активного ила были иммобилизованы на активированном угле в соотношении ил:носитель – 1:5.

Принятое в работе соотношение ила и носителя 1:5 основано на том, что соотношение 1:10 было показано как оптимальное при создании микробного биосенсора для детекции п-толуолсульфоната, а в активном иле часть составляют живые микроорганизмы, а часть взвешенные вещества.

Полученные результаты по уменьшению концентрации фенола представлены на рис. 20.

Рис. 20. Уменьшение содержания фенола в ходе экспериментов.

 

На кривой 1 показано уменьшение концентрации фенола в ходе экспериментов на колонке без аэрации. На кривой 2 показаны результаты на колонках с аэрацией.

Полученные результаты позволяют предположить, что в  экспериментах с колонкой без  аэрации имеет место лимитирование  процесса окисления целевых веществ по кислороду. Это предположение основано на том, что в колонках различного объема получены практически одинаковые результаты по степени разложения целевых веществ и степень деструкции была низкой.

В колонках с принудительной аэрацией такого не наблюдалось, получена почти прямая зависимость деградации веществ от объема колонки. Максимальная величина снижения концентрации веществ в колонке с принудительной аэрацией, тем не менее, ниже таковой величины, полученной при работе установки биохимочистки (92%).

Таким образом, для стоков нефтеперерабатывающих производств наиболее приемлемой является существующая схема очистки стоков в аэротенках.

В рамках эксперимента проводилось  исследование активности микроорганизмов, выдержанных без сточных вод в режиме принудительной аэрации в течение 10 суток (активный ил, выведенный в минерализатор). Из данных, представленных в таблице № 10, можно увидеть, что активность ила снизилась по степени разложения аммонийного азота почти до контрольного значения. Отсюда можно сделать вывод о том, что применяемая в настоящее время регламентная схема минерализации активного ила работает успешно, ил практически теряет свои свойства и готов к утилизации на иловых картах. Анализ активности ила на иловых картах и после них не проводился.

 

Таблица № 10. Снижение концентрации аммонийного азота и фенола в экспериментах.

Эксперимент	% удаления NH4	% удаления фенола
Контроль	3	49
Колонка h = 30мм без аэрации	20	56
Колонка h = 60мм без аэрации	22	55
Колонка h = 90мм без аэрации	23	57
Колонка h = 30мм с аэрацией	26	59
Колонка h = 60мм с аэрацией	33	64
Колонка h = 90мм с аэрацией	39	69
Установка биохимочистки	88	96
Колонка h = 90 мм с илом из минерализатора	7	55

 

4.4.2. Использование полученных данных для оценки эффективности процесса очистки стоков в аэротенках установки биохимической очистки

Задачей данной части  работы была оценка состояния аэротенков очистных сооружений нефтеперерабатывающего производства и, по возможности, оптимизация их работы.

4.4.2.1. Исходное  состояние установки биохимочистки

ХПК исходного стока находилось на уровне 100 – 330 мг/л. ХПК биохимочищенной воды находилось на уровне 100 – 120 мг/л.

Концентрация растворенного  кислорода в выходящей иловой смеси по аэротенкам первой очереди  варьировалась в зависимости  от ХПК и расхода исходного стока и составляла:

Для первого аэротенка  от 0 мг/л до 3.63 мг/л

Для второго аэротенка  от 4.42 мг/л до 6.6 мг/л

Для третьего аэротенка  от 5.21 мг/л до 7.19 мг/л

Средняя концентрация кислорода  по аэротенкам второй очереди 0 мг/л. По длине аэротенков наблюдаются скачки концентрации кислорода до 2 мг/л, за счет неравномерности подачи воздуха.

Как правило, неудовлетворительная степень очистки при биохимическом окислении может быть обусловлена следующими причинами:

1.Недостаточная продолжительность  процесса, которая определяется концентрацией поступающих загрязнений (нагрузка по ХПК), химической природой загрязнений, дозой активного ила.

2.Неблагоприятные условия  обитания активного ила: недостаточное  снабжение кислородом, биогенными  веществами (азот, фосфор, калий), температура среды, отклонение рН от оптимальных значений.

Проведенный анализ позволил выделить наиболее возможные причины  неудовлетворительной очистки промышленного стока:

1. Резкое изменение  химического состава промышленного  стока вследствие залповых сбросов сернистых стоков с установок предприятия.

2. Недостаточное снабжение  кислородом в ряде аэротенков.

Для подтверждения выдвинутых предположений был проведен экспресс-анализ с помощью кислородного электрода Кларка. Схема аэротенка и мест отбора проб показаны на рис. 21.

 

Рис. 21. Схема аэротенка и точек отбора проб.

Геометрические размеры  аэротенка составляют:

Длина – 39 м

Ширина – 15 м

Рабочий уровень – 3.2 м

Объем – 1860 м³

 

Как видно из приведенных в таблице № 11 данных, распределение кислорода по аэротенкам происходит неравномерно, что приводит к снижению качества очистки стоков в целом по сооружениям БХО.