Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comanonas и Pseudomonas - деструкторов n-толуолсульфона

3.1.1. Трансформация ТС свободными клетками. Процесс осуществляли свободными отмытыми клетками  в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл буфера. ТС вносили в виде водного раствора в конечной концентрации 1.25 мМ. Концентрация (по массе сухих клеток) в реакционной среде составляла 0.4 мг/мл. Для контроля динамики процесса через определенные промежутки времени из реакционной среды отбирали пробы объемом 2 мл. Концентрацию ТС измеряли после удаления клеток центрифугированием в течение 15мин при 5000 g. Концентрацию ТС определяли двумя способами: спектрофотометрически, измеряя ОП₂₆₁, или обращенно-фазовой жидкостной хроматографией высокого давления, измеряя оптическую плотность ОП₂₅₄. Значение скорости деградации рассчитывали по максимальному наклону касательной к квазилинейному участку рабочей кинетической кривой. Скорость деградации выражали в единицах удельной активности (нмоль • мин^{- 1}• мг^-1 клеток (сухой вес)).

3.1.2. Деградация ТС иммобилизованными  клетками. Трансформацию ТС клетками, включенными в агаровый гель, осуществляли в условиях, аналогичных для свободных клеток.

3.1.3. Определение скорости  ферментативной реакции клеток.

Ферментативную активность свободных  и иммобилизованных клеток оценивали  по наклону линейного участка  кинетических кривых в условных единицах активности, отнесенных к 1 г носителя или 1 мг клеток (мкМ мин^-1 мг^-1 или мкМ мин^-1 г ^–1 носителя).

3.1.4. Деградация ТС в непрерывных условиях.

Процесс осуществляли иммобилизованными  клетками в стеклянной термостатированной колонке (реактор идеального вытеснения). Рабочий объем колонки составлял 5.7 мл, диаметр 1.7 см, высота колонки 2.5 см, концентрация клеток - 5 мг/мл геля. Скорость подачи раствора в колонку варьировали от 72 до 353 мл/ч, что соответствовало удельной скорости от 12 до 62 ч ^-1. Степень трансформации субстрата, выраженная в процентах от исходной концентрации, и производительность колонки (нмоль•мин^-1•мг^-1•клеток (по сухому весу)) оценивали, измеряя концентрацию ТС в элюате.

3.1.5. Контроль процесса  деградации.

Концентрацию TС определяли двумя способами: спектрофотометрически при 261 нм на спектрофотометре (Shimadzu UV-160 A, Япония) и методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления на колонке длиной 15 см, заполненной сепаролом SGXC, C₁₈, 7 мкМ фирмы "Tessek LTD" (Чехия). Анализ осуществляли с использованием насоса HPP 5000 и UV – детектора LCD 2563 фирмы "Laboratorne Pristroje" (Чехия) при 254 нм. Подвижная фаза состояла из фосфатного буфера (рН 6.7) и метанола (85:15). Скорость протока составляла 1.5 мл/мин.

Потребление кислорода  свободными клетками измеряли на полярографе LP – 7 (ЧССР) с помощью закрытого тефлоновой пленкой платинового электрода Кларка. Начальную концентрацию кислорода в среде принимали равной 250 мкМ. В качестве среды дыхания использовали калий-фосфатный буфер, рН 7.4. Температура измерения 22 – 25^оС. Конечный объем пробы – 2 мл.

В работе использовали п-толуолсульфонат натрия ("Aldrich", США). Все остальные реактивы имели квалификацию "х.ч." ("Реахим", РФ).

3.1.6. Получение  плазмидного и бесплазмидного  варианта штамма C. testosteroni.

Элиминирование плазмиды осуществляли с целью изучения ее роли в метаболизме штамма путем обработки штамма митомицином согласно методике [202]. Полученный штамм, не содержащий плазмиды, был обозначен как C. testosteroni BS1320.

C. testosteroni BS1310 (pBS1010) выращивали в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (объем среды 200 мл) на качалке (100 об/мин) при 27°С на жидкой синтетической среде М9 с использованием 5 мМ толуолсульфоната в качестве единственного источника углерода и энергии. Культивирование C. testosteroni BS1320 производили с использованием 5 мМ сукцината в качестве единственного источника углерода и энергии; биомассу собирали центрифугированием и ресуспендировали в калий-фосфатном буфере (30 мМ, рН 7.6). Клеточную суспензию, имеющую оптическую плотность 0.4 единицы, использовали для формирования рецепторного элемента биосенсора.

3.2. Разработка  микробного сенсора для определения п-толуолсульфоната

3.2.1. Среда культивирования. Для культивирования бактерий использовали минеральную среду следующего состава (г/л): K₂HPO₄ ´ 3H₂O – 4, NaH₂PO₄ ´ 2H₂O – 0.4, NH₄NO₃ – 1, MgSO₄ ´ 7H₂O – 0.4, ZnCl₂ – 0.0205, FeCl₃ ´ 6H₂O – 0.027, MnCl₂ ´ 4H₂O – 0.01, CuCl₂ ´ H₂O – 0.00085, Co Cl₂ ´ H₂O – 0.0024, H₃BO₃ – 0.0003. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали TС в концентрации 5 мМ. Бактерии выращивали в течение 30 ч в колбах объемом 750 мл, содержащих 200 мл среды, при перемешивании на качалке (200 об/мин) при температуре 27°С. Биомассу определяли весовым методом (105^о С).

3.2.2. Иммобилизация  микроорганизмов. Иммобилизацию микроорганизмов производили включением в 2%-ный агаровый гель согласно методике, описанной в монографии. Полученную гелевую мембрану толщиной 0.3-0.5 мм и площадью 20 мм² фиксировали на измерительной поверхности электрода Кларка (тип Ingold 531-04, США), который использовали в качестве преобразователя биосенсора. Измерения проводили в кювете объемом 5 мл при температуре 20°С и постоянном перемешивании. Измерительной средой являлся 30 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7.6). Измеряемым параметром (ответом сенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt, нА/с при введении вещества.

3.2.3. Исследование  деградирующей активности микроорганизмов.

Полученные вышеописанным  способом клетки отделяли центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин., промывали калий-фосфатным буфером (30 мМ, рН 7.6). Указанный буфер использовали и в дальнейшем. Осадок суспендировали в том же буфере и использовали в работе. Клетки иммобилизовали в 2% - ный агаровый гель при температуре 45^оС. Полученный блок геля с иммобилизованными клетками фрагментировали через сито с размером ячеек 500 мкм. Концентрация клеток в геле при этом составляла 10 мг (сухой вес) на 1 мл геля. Носитель промывали буферным раствором. Для освобождения от эндогенного дыхания гранулы помещали в колбу с 0.25 мМ TС в буфере и оставляли при перемешивании на качалке (200 об/ мин) в течение 10 ч.

3.3. Разработка микробного сенсора для детекции фенола

3.3.1. Объектом исследования являлись бактериальные штаммы, выделенные из почв месторождений нефти Западной Сибири и хранящиеся в коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН. Штаммы выделялись методом накопительных культур с использованием в качестве субстрата нефти и дизельного топлива. Накопительные культуры инкубировали в жидкой среде Эванса, содержащей нефть качестве единственного источника углерода и энергии, в течение 3-5 дней. Разведения высевали на агаризованную среду Е с нефтью. Отдельные колонии, выросшие на нефти, пересевали. Выделено свыше 100 штаммов – деструкторов нефти и нефтепродуктов. Отдельные штаммы проверялись на способность к росту на индивидуальных субстратах – компонентах нефти: нафталине, 2- метил - нафталине, фенантрене, гексадекане, м-крезоле, феноле и ряде других. Двадцать восемь штаммов оказались способны к утилизации фенола.

Для культивирования утилизирующих  фенол микроорганизмов использовали минеральную среду Е. Состав среды Эванса следующий (г/л или мл/л): K₂HPO₄ – 8.71 г, 5 M раствор NH₄CI – 1 мл, 0.1 M раствор Na₂SO₄ – 1 мл, 62 мM раствор MgCI₂ – 1 мл, 1 мM раствор CaCI₂ – 1мл, 0.005 мM раствор (NH₄)₆Mo₇O₂₄×4H₂O, микроэлементы – 1мл (состав микроэлементов в г/л): ZnO – 0.41 г, FeCI₃×6 H₂O – 5.4 г, MnCI₂×4H₂O – 2 г, CuCI₂×2H₂O – 0.17 г, CoCI₂×6H₂O – 0.48 г, H₃BO₃ – 0.06 г, (pH 7.0).

Для получения агаризованной  среды того же состава в нее  добавляли 1.5% агара. В качестве единственного  источника углерода и энергии  использовали пары фенола.

3.3.2. Штаммы-деструкторы фенола. В эксперименте были использованы 8  штаммов грамотрицательных бактерий, отобранные из 28 штаммов, способных к росту на моноциклических ароматических субстратах, в том числе на феноле, и характеризующиеся наибольшей скоростью роста, и 1 штамм-деструктор нафталина (P.putida BS394(p20)). Штаммы были предоставлены для исследований Лабораторией биологии плазмид ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН и исходно были выделены из почв нефтяных месторождений Западной Сибири.

Проводилась предварительная  идентификация отобранных штаммов. Высев штаммов на среду KingB и дальнейший анализ под UV показал, что все 9 штаммов относятся к флуоресцирующим псевдомонадам. Далее видовую принадлежность штаммов флуоресцирующих псевдомонад определяли на основании ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction analysis) продуктов амплификации гена 16S рРНК с использованием мелкощепящих эндонуклеаз рестрикции RsaI, MspII и HaeIII. Рестрикционные фрагменты 16S рДНК разделяли электрофоретически в 2%-м агарозном геле. В качестве контрольных штаммов использовали хорошо изученные и охарактеризованные штаммы P. putida mt-2 (Nelson et al., 2002), P. fluorescens 2-79 (Weller, 1983) и P. aeruginosa PAK NP1 (Delaney et al., 2001). Результаты ARDRA показал, что 7 из используемых штаммов принадлежат предположительно к P. putida mt-2 и только один из них А-13 по- видимому, относится к P. fluorescens

Исследовалась способность  выбранных штаммов к росту  на различных субстратах. Ни один из штаммов не был способен к росту на полициклических ароматических углеводородах. Штаммы росли на бензоате. Штамм А-13 помимо способности к росту на феноле, мог использовать также гексадекан в качестве единственного источника углерода и энергии.

 3.3.3. Иммобилизацию клеток проводили методом физической сорбции на хроматографической бумаге, для чего 10 мкл клеточной суспензии наносили на бумагу (5´5 мм²) и высушивали в течение 20 мин. Сформированный таким образом рецепторный элемент фиксировали на рабочей поверхности кислородного электрода Кларка. Измеряемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала (dI/dt, нА/c). Измерения проводили в кювете открытого типа емкостью 5 мл при 20^оС и постоянном перемешивании раствора.

3.3.4. Хранение  бактериальных штаммов осуществляли в микроаэрофильных условиях при 4°С в полужидкой богатой среде под вазелиновым маслом. В качестве богатой среды для выращивания бактерий использовали среду LB следующего состава (г/л): триптон – 10, дрожжевой экстракт – 5, NaCl – 10. Микроорганизмы выращивали при 27°C.

3.3.5. Скорость  окисления субстрата бактериальными  клетками определяли полярографически. Измеряемым параметром являлось изменение максимальной скорости выходного сигнала (dI/dT, нА/c). В качестве преобразователя использовали амперометрическую систему Ingold 531-04 (USA). Измерения производили в кювете открытого типа емкостью 5 мл при температуре 20^оС и постоянном перемешивании раствора. В качестве измерительной среды использовали 30 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7.6).

Бактериальные клетки выращивали до начала стационарной фазы роста на агаризованной среде указанного выше состава. После образования  сплошного газона (1-2 суток) клетки смывали 30 мМ калий-фосфатным буфером (рН 7.6), осаждали центрифугированием на центрифуге Eppendorf (тип 5413, UK), в течение 3 мин при 15000 g и промывали буфером того же состава.

3.4. Характеристика полярографической измерительной системы

В исследованиях для  регистрации интенсивности окислительного метаболизма бактериальных клеток применяли преобразователи амперометрического типа, характеризующиеся следующим набором параметров: диапазон рабочих токов при содержании кислорода в измеряемой среде, содержащей 9 мг О₂/л, составлял 60 нА, величина темнового тока не превышала 2% от тока в среде, содержащей 9 мг О₂/л, периодичность измерения составляла 5-7 проб в час, операционная стабильность - не менее 10 сут, аналитическая чувствительность  (максимальная скорость изменения сигнала при вводе пробы) - не ниже 0.5 ´ 10-3, погрешность измерения составила не более 3%, мощность – 30 Вт, рабочая температура - 20^оС.

Использовался кюветный и проточно-инжекционный типы измерения с диапазоном скоростей протока в пределах от 0.1 до 5 мл/мин. Исследования интенсивности окислительного метаболизма бактериальных клеток, а также процессов окисления органических субстратов в присутствии искусственных акцепторов электронов, выполнялись с использованием специализированных гальванопотенциостатов, обеспечивающих регистрацию тока в диапазоне от ± 0.1 нА до ± 10 мА.

3.5. Деградация фенола в колоночном реакторе с иммобилизованным активным илом установки биохимочистки стоков (БХО)

3.5.1. Отбор проб активного  ила проводился из аэротенков БХО, после 30 мин отстаивания он использовался для эксперимента. Время отстаивания 30 мин было выбрано, поскольку именно такое время отстаивания принято в стандартной методике определения илового индекса [203].

Иловый индекс отобранных проб ила  составлял от 70 до 100, что соответствует требованиям технологического регламента работы установки БХО.

3.5.2. Иммобилизацию активного  ила проводили путем физической сорбции на активированном угле с размерами гранул l = 1-5 мм, d = 1 мм. Объем иммобилизованного активного ила варьировался в зависимости от объема колонки и составлял от 5 до 15 мл (соотношение ил: уголь составляло 1:5).

3.5.3. Условия эксперимента. Реакционной средой эксперимента являлся входящий сток установки биохимочистки сточных вод. Геометрические размеры колонки составляли: h = 90 мм, d = 30 мм. Использовалось три варианта заполнения колонки с высотой заполнения соответственно 30, 60 и 90 мм. Объем колонки при этом составлял соответственно 21, 42 и 63 мл. Помимо этого варьировалась условия аэрации. Во всех трех случаях использовались варианты колонок без аэрации и с принудительной аэрацией. Для принудительной аэрации использовался воздух КИП (приблизительный расход 5 л/ мин). Кроме того, были исследованы свойства ила, находившегося в отсутствие субстрата с аэрацией 10 суток (ил из минерализатора).