Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comanonas и Pseudomonas - деструкторов n-толуолсульфона

Нижний предел детекции ТС штаммом C. testosteroni в проточной системе при скорости 0.5 мл/мин составил 5 мкМ, что сравнимо с чувствительностью в стационарной кювете. Но, учитывая короткое время контакта (8.5 с), чувствительность может оказаться выше, чем в стационарной кювете. Верхний предел детекции составил порядка 1 мМ, что также сопоставимо с данным показателем для стационарной системы. Но амплитуды ответов на высокие концентрации были существенно ниже по сравнению с кюветным методом. Это также можно объяснить коротким временем контакта вещества с электродом. На рис. 9 представлена калибровка по ТС в проточной системе на скорости 0.05 мл/мин с иммобилизованными на GF микроорганизмами. При данных условиях сенсор давал устойчивый ответ на концентрации толуолсульфоната 250 нМ, поскольку время контакта пробы с раствором составляло 85 с. Базовый уровень при этом имел вид сжатой синусоиды, шумы убирали с помощью программы "sensor". Скорость развертки на полярографическом анализаторе составляла 0.5 (1 см = 200 с).

Колебания базового уровня содержания кислорода в проточной системе при наличии микроорганизмов на электроде имели меньшую амплитуду, чем без микроорганизмов. Очевидно, это объясняется тем, что микроорганизмы поддерживают относительно стабильный уровень дыхания, и поэтому эффект от каждой новой порции раствора сглаживался.

Проверка субстратной  специфичности в проточной системе  дала те же результаты, что и в  стационарной кювете. Получены высокие  ответы на ацетат, этанол, глюкозу. Время, в течение которого сенсор на основе микроорганизмов, иммобилизованных на бумаге GF, проявлял стабильность показателей, составляло от нескольких часов до двух дней, т.е. столько же, сколько в стационарной кювете.

 

Рис. 11. Калибровка биосенсора на основе иммобилизованных в агаровый гель клеток C. testosteroni BS1310(pBS1010) в проточной системе при скорости протока 0.05 мл/мин.

 

4.3. Разработка микробного биосенсора для детекции фенола

4.3.1.Скрининг штаммов-деструкторов фенола

Поиск микроорганизмов, способных к деструкции фенола, производился среди штаммов, выделенных из нефтяных месторождений Западной Сибири сотрудниками Лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН.

Характерной особенностью бактериальных клеток, выделенных из почв нефтяных месторождений Западной Сибири, являлась их способность к росту на нефти и нефтепродуктах (дизельное топливо, мазут) в качестве единственного источника углерода и энергии. Из 300 культур микроорганизмов-деструкторов нефти к росту на моноциклических ароматических субстратах, в том числе на феноле, были способны 28 штаммов. Культуры существенно различались по скорости роста на феноле; для исследований были отобраны 9 штаммов, отличавшихся наибольшей скоростью роста. Отобранные микроорганизмы принадлежали к грамотрицательным бактериям и были использованы для формирования биорецепторов сенсора. Поскольку одной из основных характеристик сенсора является его избирательность по отношению к анализируемому веществу, представлялось целесообразным начать исследование с оценки субстратной специфичности штаммов.

Результаты  оценки субстратной специфичности  сенсоров на основе исследованных штаммов приведены на рис. 12. Для оценки субстратной специфичности использовали вещества различных классов - спирты, сахара, фенолы. Из приведенных на рисунке величин аналитических сигналов видно, что добавление фенола и катехола у всех исследованных штаммов активировало дыхание, что свидетельствует о потенциальной возможности их использования в рецепторных элементах.

Рис. 12. Cубстратная специфичность исследованных штаммов. Все субстраты подавались в концентрации 10 мМ.

1-фенол, 2-этанол, 3-глицерин, 4-сорбит, 5-сорбоза, 6-ксилоза, 7-бутанол, 8-изопропанол, 9-глюкоза, 10-ксилит, 11-нафталин, 12-арабит, 13-катехол, 14-метанол, 15-пропанол, 16-изобутанол, 17-ацетат, 18-п-толуолсульфонат, 19-бензолсульфонат, 20-арсенит, 21-динитроортокрезол, 22-гранозан.

Штаммы:

1-394(р20), 2-А-13, 3-45-1, 4-32-I, 5-50-III, 6-81-I, 7-89-I, 8-74-III, 9-74-I.

Численные значения по субстратной специфичности фенолдеградирующих штаммов приведены в таблице № 4.

 

Таблица № 6. Субстратная специфичность исследованных фенолдеградирующих штаммов.

Штамм № п/п	74-1	74-3	89-1	81-1	50-III	32-1	45-1	A-13	394(p20)
1	0.0038	0.0731	0.052	0.0831	0.162	0.1654	0.1323	0.0754	0
2	0.0029	0.0346	0.019	0.0092	0.011	0.0092	0.0085	0	0.0146
3	0	0.0038	0.0015	0.0023	0.0031	0.0039	0.0023	0.0008	0
4	0	0	0	0	0	0	0	0	0
5	0	0	0	0	ингибир.	0	0	0	0
6	0	0	0.0131	0.0146	0.031	0.085	0.022	0.0054	0
7	0	0	0	0	ингибир.	0	0	0	0
8	0	0	0.0185	0.0331	0.0342	0.0115	0.007	0.011	0
9	0	0	0.037	0.0346	0	0.1562	0.078	0.0077	0.03
10	0	0.0096	0.0054	0.0515	0.024	0.113	0.102	0.0054	0.0077
11	0	0.0038	0.0046	0.0038	0.0062	0.0031	0.0015	0.0023	0.0039
12	0	0	0	0	0.0023	0	0	0	0.0023
13	0.0019	0.0038	0.0085	0.0088	0.0231	0.0085	0.015	0.0031	0.0042
14	0	0.0038	0.0019	0.0062	0.0019	0.0031	0.01	0	0.0015
15	0	0.0192	0.0185	0.0077	0.01	0.0085	0.0123	0.0046	0.0192
16	0	0	0	0	0.0012	0	0	0	0.0092
17	0.0058	0.0231	0.054	0.0138	0.0954	0	0.019	0.0019	0.0331
18	0.0004	0.0027	0.075	0.0215	0.0677	0.0131	0.0154	0.0038	0.0362
19	0.0003	0.0023	0.026	0.0077	0.0038	0.0065	0.007	0.0015	0.0231
20	0	0.0042	0.056	0.04	0.0662	0.0169	0.1031	0.0046	0.032
21	0	0.0154	0.02	0.01	0.0092	0.0019	0.007	0	0.022
22	0	0.0039	0.049	0.0485	0.0462	0.0015	0.034	0.0254	0.0423

Помимо амплитуды сигнала  на введение фенола, с целью подбора  штамма, наиболее подходящего для  его детекции, было рассчитано соотношение величины сигнала сенсора на фенол к общей сумме величин сигналов на остальные вещества. Назовем эту величину условно "Критерий селективности". Данные расчетов и амплитуды сигналов на фенол приведены в таблице № 5.

 

Таблица № 7. Величины сигналов сенсоров на фенол и отношение сигналов на фенол к общему мешающему сигналу.

Исследуемый штамм	Амплитуда сигнала на фенол (Сф)	Сумма сигналов, вызванных  присутствием мешающих соединений (Сп)	Критерий селективности, Сф/Сп
74-1	0.00038	0.0017323	0.22
74-3	0.00731	0.03865	0.19
89-1	0.0052	0.0408	0.127
81-1	0.00831	0.03133	0.265
50-III	0.0162	0.04365	0.371
32-1	0.01654	0.04419	0.374
45-1	0.01323	0.044915	0.294
A-13	0.00754	0.007752	0.973
394(p20)	0	0.02813	0

 

В таблице № 7 отображен расчет субстратной специфичности для плазмидного и бесплазмидного вариантов штамма 32-I по аналогии со штаммом C.testosteroni.

Как видно из таблицы, наибольшим значением критерия селективности  обладал штамм А-13, второе по величине значение было у штамма 32-1. В то же время, сигналы у штамма А-13 имели  низкую амплитуду по отношению ко всем веществам. Кроме того, для штамма А-13 не было показано наличие плазмиды биодеградации фенола. Больший интерес представлял штамм 32-I, обладающий плазмидой. Наличие плазмиды позволяло исследовать характеристики сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного вариантов для оценки возможности их использования в качестве дифференциальной пары для селективной детекции фенола (по аналогии с плазмидным и бесплазмидным штаммом C.testosteroni).

4.3.2. Характеристика  штамма 32-I. (Субстратная специфичность)

Наибольшее  внимание для дальнейшего исследования заслуживали параметры штамма 32-I, для которого характерным являлись наиболее высокие значения аналитических сигналов в ответ на введение фенола и катехола, превышавшие отклики на сахара в 5 – 7 раз; остальные штаммы характеризовались более низкой избирательностью по отношению к фенолу. Для всех штаммов была характерна широкая субстратная специфичность, изменение дыхания (сигналы сенсоров) в ответ на введение в измерительную кювету моносахаров (кроме глюкозы и ксилозы) было менее существенным (в 2 – 3 раза ниже), чем в ответ на добавление низкомолекулярных спиртов с неразветвленной цепью (этанол, пропанол, бутанол). Таким образом, при измерении концентрации фенола в средах сложного состава следует учитывать возможность искажения сигнала при наличии в среде низкомолекулярных спиртов с неразветвленной цепью.

Изучение генетического  контроля деградации фенола показало, что, по крайней мере, у двух штаммов, 32-I и 83-IV, в трансформации этого  соединения участвуют плазмиды размером около 100 тпн. Одним из доказательств плазмидного контроля деградации фенола является тот факт, что полученный нами бесплазмидный вариант штамма 32-I утрачивал способность к росту на феноле.

4.3.3. Характеристика  сенсоров на основе плазмидсодержащего  и бесплазмидного вариантов штамма 32-I

Штамм 32-I (плазмидный вариант) проявил высокую избирательность по отношению к фенолу, величина отклика сенсора на его основе в присутствии фенола существенно превышала величину отклика на другие использовавшиеся в эксперименте соединения. Этот штамм, несущий плазмиду биодеградации фенола, был исследован более детально как потенциальная основа рецептора биосенсора для определения фенола в водных растворах.

На рис. 13 представлен сравнительный портрет субстратной специфичности плазмидсодержащего и бесплазмидного вариантов штамма 32-I. Сенсор на основе бесплазмидного варианта был нечувствителен к фенолу; чувствительность к остальным субстратам была сравнима с таковой для сенсора на основе плазмидсодержащего варианта штамма 32-I. 

Рис. 13. Диаграмма субстратной специфичности сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного вариантов штамма 32-I. Субстраты вводились в концентрации 10 мМ.

Обозначение субстратов: фенол –1. катехол – 2, салицилат  – 3, гентизат – 4, бензоат – 5, ДНФ – 6, ДНОК – 7, глюкоза – 8, сорбоза – 9, ксилоза – 10, галактоза – 11, манноза – 12, изопропанол – 13, этанол – 14, бутанол – 15, метанол – 16.

 

Таблица № 8. Анализ субстратной специфичности сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного варианта штамма 32-I.

Исследуемое вещество	Величина сигнала сенсора на основе бесплазмид-ного штамма	Величина сигнала сенсора на основе плаз-мидного штамма	Разница величин сигналов сенсоров
1 – фенол	0.0082	0.175	0.167
2 – катехол	0.0047	0.091	0.086
3 – салицилат	0.0082	0.019	0.0105
4 – гентизат	0.007	0.012	0.0047
5- бензоат	0.012	0.014	0.002
6 – ДНФ	0	0.012	0.012
7 – ДНОК	0	0	0
8 - глюкоза алкилалкилбензолсульфонат алкилбензолсульфонат алкилбензолсульфонат	0.035	0.035	0
9 – сорбоза	0.009	0.009	0
10 – ксилоза	0.0105	0.021	0.0105
11 – галактоза	0.007	0.015	0.008
12 – манноза	0.029	0.026	-0.003
13 – изопропанол	0.007	0.007	0
14 – этанол	0.016	0.028	0.012
15 – бутанол	0.014	0.012	-0.002
16 – метанол	0.007	0.012	0.005
Суммарная разница			0.1457
Разница величин сигналов на целевое вещество			0.167

 

Погрешность (добавочный сигнал) при определении фенола в  присутствии всех мешающих веществ составляет 87,2%, в присутствии всех веществ, кроме катехола – 35,7%. При осуществлении дифференциальной детекции необходимо будет нормировать показания с учетом этих расчетов. При интегральном определении всех ароматических соединений, содержащихся в пробе, погрешность на мешающие вещества составляет 12.7%. Поэтому использовать данный сенсор для интегрального определения фенолов в реальных образцах можно при анализе стоков, содержащих преимущественно фенольные соединения. В этом случае погрешность, вызванная присутствием остальных классов соединений, будет незначительной, поскольку величина 12.7% получена для ситуации, при которой все соединения (и целевые, и мешающие), находятся в среде в одинаковой концентрации.

Таким образом, селективность  сенсора на основе штамма 32-I сопоставима с селективностью сенсора на основе C.testosteroni (11% и 12%, соответственно). Данные по величине погрешности для дифференциальной пары на основе штамма 32-I представлены в таблице № 9.

 

Таблица № 9. Величины погрешности для дифференциальной пары на основе штамма 32-I при различных условиях исследования.

Тип анализируемой смеси	В присутствии катехола	В отсутствие катехола
Фенол – единственное ароматическое соединение в смеси	87.2%	35.7%
Присутствует несколько  ароматических соединений	12.7%

 

Калибровочная зависимость  плазмидсодержащего штамма 32-I, полученная для фенола, представлена на рис.14. Диапазон детекции составлял 5 – 1000 мкМ фенола. Более высокие концентрации фенола вызывали ингибирование дыхания клеток. Этот эффект, по-видимому, носит достаточно общий для микробных клеток характер, поскольку аналогичные результаты были получены для амперометрического биосенсора на основе Pseudomonas putida [142].

 

Рис. 14. Калибровочная кривая сенсора на основе иммобилизованных клеток плазмидсодержащего варианта штамма 32-I. Исследуемое вещество - фенол.

 

Следует отметить, что  нижний предел детекции фенола для  сенсора на основе штамма 32-I был сопоставим с аналогичным параметром для моделей сенсоров, описанных в литературе. Так, нижний предел детекции для сенсора на основе Trichosporon cutaneum составил 2 мкМ [55], для сенсора на основе Rhodococcus его величина составила 4 мкМ [165].