Автор работы: Пользователь скрыл имя, 01 Марта 2013 в 14:24, диссертация
Цель исследования. Целью работы являлось создание биосенсоров электрохимического типа для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas, являющихся деструкторами п-толуолсульфоната и фенола, соответственно.
Список используемых сокращений 6
1. ВВЕДЕНИЕ 7
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Биосенсоры как направление
в аналитической биотехнологии 13
2.1. Типы преобразователей, используемые в
биосенсорах. Электрохимические преобразователи 14
2.2. Типы биологических материалов, применяемых в
рецепторных элементах биосенсоров 15
2.2.1. Сенсоры на основе ферментов, антител и
иммунных комплексов, ДНК, животных и
растительных клеток, клеточных органоидов 15
2.2.2. Сенсоры на основе микробных клеток 17
2.2.2.1. Микробные сенсоры в мониторинге газовых
и водных сред 19
2.2.2.1.1. Мониторинг атмосферы 19
2.2.2.1.2. Мониторинг гидросферы 20
2.2.2.2. Классы соединений, детектируемых с помощью
микробных биосенсоров 21
2.2.2.2.1. Определение БПК 21
2.2.2.2.2. Детекция мутагенов и поллютантов 25
2.2.2.2.3. Сенсоры для определения анионных
поверхностно-активных веществ (ПАВ) 28
2.2.2.3. Методы иммобилизации биологического
материала в рецепторном элементе сенсора 29
2.3. Микроорганизмы-деструкторы и их использование
в разработке биосенсоров для детекции токсичных
соединений 30
2.3.1. Микроорганизмы-деструкторы токсичных соединений 30
2.3.2. Методы направленной модификации
микроорганизмов для придания им деструктивных свойств 34
2.3.3. Плазмидная детерминированность генов биодеградации 35
2.4. Потребности в детекции ароматических и
сульфоароматических соединений 36
2.4.1. Ароматические соединений и их влияние на экосистемы 36
2.4.2. Краткая характеристика сульфоароматических
соединений 36
2.4.3. Возможный механизм биодеградации
толуолсульфоната (ТС) 37
2.5. Характеристика штамма Comamonas testosteroni 38
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
3.1. Изучение Исследование способности микроорганизмов
к деградации толуолсульфоната (ТС) 41
3.1.1. Трансформация ТС свободными клетками 41
3.1.2. Деградация ТС иммобилизованными клетками 42
3.1.3. Определение скорости ферментативной реакции клеток 42
3.1.4. Деградация ТС в непрерывных условиях 42
3.1.5. Контроль процесса деградации 43
3.1.6. Получение плазмидного и бесплазмидного варианта
штамма C. testosteroni 43
3.2. Разработка микробного сенсора для определения
п-толуолсульфоната 44
3.2.1. Среда культивирования 44
3.2.2. Иммобилизация микроорганизмов 44
3.2.3. Исследование деградирующей активности
микроорганизмов 44
3.3. Разработка микробного сенсора для детекции фенола 45
3.3.1. Объект исследования 45
3.3.2. Штаммы-деструкторы фенола 46
3.3.3. Иммобилизация клеток 46
3.3.4. Хранение беактериальных штаммов 47
3.3.5. Скорость окисления субстрата
бактериальными клетками 47
3.4. Характеристика полярографической измерительной
системы 48
3.5. Деградация фенола в колоночном реакторе с
иммобилизованным активным илом установки
биохимочистки (БХО) 49
3.5.1. Отбор проб активного ила 49
3.5.2. Иммобилизация активного ила 49
3.5.3. Условия эксперимента 49
3.5.4. Контроль на входе и выходе колонки 49
3.5.5. Данные по работе установки биохимочистки 49
3.5.6. Определение фенола 50
3.6. Оптимизация работы установки БХО 50
3.6.1. Концентрация растворенного кислорода 50
3.6.2. Проведение замеров 50
3.7. Статистическая обработка полученных результатов 50
3.8. Основные технические параметры анализатора 50
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 51
4.1. Биодеградация ТС с помощью
C.testosteroni BS1310(pBS1010) 52
4.1.1. Деградация ТС свободными и иммобилизованными
клетками в периодических условиях 52
4.1.2. Деградация ТС в непрерывных условиях 54
4.2. Сенсор для детекции п-толуолсульфоната (ТС) 57
4.2.1. Скрининг штаммов-деструкторов арилсульфонатов 57
4.2.2. Характеристика штамма Comamonas testosteroni 57
4.2.3. Характеристика сенсоров на основе
плазмидсодержащего и бесплазмидного штамма C. testosteroni 58
4.2.4. Исследование работы сенсора на основе клеток
Comamonas testosteroni в проточной системе 76
4.3. Разработка микробного биосенсора для детекции
фенола 80
4.3.1.Скрининг штаммов-деструкторов фенола 80
4.3.2. Характеристика штамма 32-I
(Субстратная специфичность) 84
4.3.3. Характеристика сенсоров на основе
плазмидсодержащего и бесплазмидного вариантов
штамма 32-I 85
4.4. Возможные пути решения практических задач
с применением биосенсорного подхода 97
4.4.1. Деградация целевых соединений сточных вод
иммобилизованными на колонке микроорганизмами
установки биохимочистки сточных вод (БХО) 100
4.4.2. Использование полученных данных для оценки
эффективности процесса очистки стоков в аэротенках
установки биохимической очистки 106
4.4.2.1. Исходное состояние установки биохимочистки 106
4.4.2.2. Результаты проведенных технических и
технологических мероприятий на сооружениях БХО 111
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 116
6. ВЫВОДЫ 118
7. ЛИТЕРАТУРА 120
Микроорганизмы
с широкой субстратной
2.3.2.
Методы направленной
В свете последних достижений в области микробиологии и биотехнологии помимо поиска появилась возможность конструирования новых штаммов микроорганизмов, способных к более эффективной деградации органических загрязнителей до менее токсичных продуктов, вплоть до углекислого газа и воды [4]. Наиболее токсичны для окружающей среды соединения, имеющие тенденции к накоплению, такие как дихлордифенилтрихлорэтан (ДДТ), альдрин, полихлорбифенилы, 2, 4 - Д; 2, 4, 5 - Т [152]. Хлорированные фенолы и их производные, которые используются в качестве гербицидов, фунгицидов и общих биоцидов, также являются токсичными ксенобиотиками. Большое количество фенолов образуется в процессе хозяйственной деятельности человека [142].
Для уничтожения ксенобиотиков в окружающей среде выгоднее использовать не отдельные микроорганизмы, а микробные сообщества, поскольку в результате действия группы микроорганизмов токсичные продукты одних штаммов могут усваиваться другими штаммами [122].
В разработке специализированных штаммов для разложения ксенобиотиков применяются два подхода:
1. Разработка чистой культуры, способной разлагать специфические компоненты.
2. Разработка
культуры неизвестного состава,
Применение
высокоэффективных
1). Генная инженерия in vivo, когда некоторые специфические генетические элементы вводятся в плазмиды для придания микробным штаммам возможности изменения генетического материала и создания новых сочетаний генов, а также для расширения спектра разлагаемых субстратов [193].
2). Мутагенез
и отбор. При этом проводится
работа по выделению микроорган
2.3.3. Плазмидная детерминированность генов биодеградации
В начале 1970-х гг появились первые публикации об открытии у бактерий плазмид биодеградации (D - плазмид), определяющих способность бактерий разлагать устойчивые в условиях окружающей среды органические соединения, такие как толуол и ксилолы, нафталин, бифенил или хлорароматические компоненты, 3 - хлорбензоат и 2, 4 - дихлорфеноксиуксусная кислота. Количество и разнообразие плазмид биодеградации постоянно растет [194]. Конъюгативность плазмид биодеградации обеспечивает возможность конструирования новых активных биодеградантов с повышенной экспрессией полезных функций.
Примером может служить штамм В13, который не способен к деградации салицилата и хлорсалицилатов. При перенесении плазмиды из штамма NAH7, в которой, кроме других, находится ген, кодирующий салицилатгидролазу, получили трансконъюгант, способный разлагать 3, 4, и 5 - хлорсалицилаты [191].
Перспективным может быть поиск микроорганизмов, способных к деградации целевых соединений, с помощью биосенсорной методики [195]. В частности, с помощью такого метода был отобран ряд микроорганизмов, способных к деградации хлорфенолов, хлорбензоатов, 2, 4 - D, дибензофуранов и их интермедиатов.
2.4. Потребности в детекции ароматических и сульфоароматических соединений
2.4.1. Ароматические соединения и их влияние на экосистемы
Ароматические соединения и их производные, используемые в различных отраслях промышленности, а также как биоциды в сельском хозяйстве, относятся к ксенобиотикам. Они характеризуются токсичностью и сравнительно устойчивы к микробной деградации ввиду относительно высокой энергии разрыва ароматического кольца, что делает нежелательным их попадание в окружающую среду. Существуют различные микроорганизмы, способные к деградации ароматических и галоароматических соединений [196-198]. В природе фенолы образуются в процессах гумусообразования [141], чем и обусловлено наличие фенолдеградирующих микроорганизмов в почвенных сообществах. Микробная деградация фенола тщательно изучена. Показано, что основным промежуточным продуктом окисления фенола является катехол. Катехол в дальнейшем метаболизируется по орто - или мета - путям для образования соединений, необходимых для жизнедеятельности клетки [141]. Ключевые реакции процесса деградации фенола включают усвоение кислорода.
2.4.2. Краткая характеристика сульфоароматических соединений
Сульфокислоты принадлежат к числу наиболее сильных органических кислот. Они представляют собой кристаллические вещества, легко растворимые в воде и часто гигроскопичные, вследствие чего их обычно выделяют в виде солей. Многие ароматические сульфокислоты и их соли являются важными промежуточными продуктами в промышленном органическом синтезе [199] и широко применяются в химической промышленности. П-толуолсульфокислота (ТС) используется при производстве крезола, дезинфицирующих лекарственных веществ, ядохимикатов, ПАВ, полимеров, что ведет к ее появлению в стоках химических предприятий. ТС является нормируемым в воде соединением: ПДК п-толуолсульфокислоты - 1.0 мг/л, ПДК ее натриевой соли - 0.05 мг/л. В 1990 году было произведено 2 млн. тонн линейных алкилбензолсульфонатов, 86000 тонн аминосульфонатов и 289000 тонн алкилсульфатов [12].
Существующие аналитические методы определения сульфокислот рассматриваются в книге [200]. Эти методы подразделяются на три основные группы: химические, физические и инструментальные.
Химические методы включают в себя:
а) Реакцию с основаниями,
б) Пиролиз с элиминированием SO2,
в) Этерификацию с диазометаном.
Из физических методов применяются УФ - и ИК - спектрометрия, а также следующие хроматографические методы:
а) Колоночная хроматография,
б) Бумажная хроматография,
в) Тонкослойная хроматография,
г) ВЭЖХ.
Для качественного определения сульфокислот используется образование солей с ароматическими аминами, лучше всего с анилином, о - или п - толуидином или с хлоридом бензилизотиурония [199].
2.4.3. Возможный
механизм биодеградации
Для штамма C.testosteroni BS1310 показано [159] наличие пути катаболизма TС, заключающегося в первоначальном десульфонировании и последующем окислении 4- метилкатехола по мета - пути. Первые две реакции данного пути идут с участием диоксигеназ с потреблением кислорода.
Ранее участие ферментов мета - окисления катехола в деградации бензолсульфоната (БС) продемонстрирована Ripin et al.[159] для штамма C.testosteroni H - 8. Однако деструкция TС бактериями этого вида, описанная Locher et al. [180] для штамма C.testosteroni T - 2, протекала путем мета - окисления образующегося протокатехата. Деструкция TС через мета - окисление 4 - метилкатехола описана для бактериальных штаммов - деструкторов, в том числе Cain & Farr [182] для флюоресцирующих псевдомонад, а также Bird & Cain [159] для штамма Alcaligenes sp. Данные также говорят в пользу участия катехол - 2, 3 - диоксигеназы в утилизации штаммом C.testosteroni BS1310 как БС, так и TС [159].
2.5. Характеристика штамма Comamonas testosteroni
Штамм C. testosteroni - грамотрицательная аэробная палочка, описанная ранее (Locher et al., 1989; Thurnheer et al., 1986) и образующая на агаре круглые (1.5 - 2.5 мм), прозрачные однообразные колонии [191]. Штамм, выделенный из активного ила завода по переработке сточных вод Vidy (Lausanne, Switzerland), был определен и назван C.testosteroni L - 1 [192]. Штамм C. testosteroni T - 2 был получен из института микробиологии (ETH Zurich, Switzerland). Оба штамма высевались на селективной (сульфоароматические соединения в качестве источника углерода) и неселективной (содержащей агар PCA) среде [192]. C. testosteroni L - 1 был более устойчив к низким значениям рН, вплоть до 5. Применялись два одинаковых стационарных колоночных реактора с биомембранами из нейлоновых волокон, имеющих рабочий объем 66 мл. Было показано, что C. testosteroni T - 2 был более эффективен в усвоении целевого вещества и общего органического углерода, чем L - 1 [192].
C. testosteroni T - 2 разрушал п-толуолсульфонат через окисление метиловой группы до п-сульфобензоата и затем до клеточного материала, СО2 и сульфата. C. testosteroni L - 1 разрушал ТС, который составлял почти 100% общего органического углерода, имеющегося в культурах, быстрее и без регистрируемых сульфонированных промежуточных соединений [192]. Разнообразие микроорганизмов в колонке, засеянной C. testosteroni T - 2 было в 2 - 3 раза меньшим, чем с C. testosteroni L - 1. Это можно объяснить выработкой п-сульфобензоата C. testosteroni [192].
Механизм биодеградации ТС рассматривался в гл. 2.4.3.
Штамм C. testosteroni при выращивании на богатой среде терял способность усваивать TС в качестве единственного источника углеродного питания, а также в качестве единственного источника серы. Данные варианты были обозначены C. testosteroni BS1320. Это позволило сделать предположение, что способность усваивать TС в штамме C. testosteroni BS1310 детерминируется плазмидами. Для его проверки были проведены выделение и визуализация плазмидной ДНК. Выявлено наличие одной плазмиды размером около 130 тпн. Данная плазмида была обозначена pBS1010. Анализ вариантов штамма C. testosteroni BS1310, потерявших способность расти на TС, показал отсутствие в них плазмиды pBS1010. Для подтверждения участия плазмиды pBS1010 в катаболизме TС и проверке ее конъюгативности был проведен опыт по конъюгационному переносу данной плазмиды. Частота конъюгационного переноса плазмиды из штамма C. testosteroni BS1310 (pBS1010) в реципиентные штаммы C. testosteroni BS1330 и C. testosteroni BS1322 равнялась 5.6 ´ 10-6 и 2.1 ´ 10-8 соответственно [194]. Таким образом, плазмида pBS1010 сообщала бактериальным клеткам способность утилизировать данное соединение, как в качестве единственного источника углерода, так и в качестве единственного источника серы [159]. Для трансконъюгантного и плазмидного штамма характерна высокая активность катехол -2, 3 - диоксигеназы. Бесплазмидный штамм демонстрировал отсутствие данной активности, что подтверждает участие катехол -2, 3 - диоксигеназы в деструкции TС, а также доказывает локализацию гена данного фермента на плазмиде pBS1010. Плазмида способна к конъюгационному переносу между штаммами C. testosteroni [159]. Потребление кислорода, происходящее при деградации TС, позволяет рассматривать бактерии C. testosteroni BS1310 (pBS1010) в качестве потенциального рецепторного элемента биосенсора с амперометрическим типом регистрации. C. testosteroni T - 2 деградирует ТС через п-сульфобензоат (PSB) [159]. Известны все ферментные белки пути расщепления ТС C. testosteroni T - 2 и структура оперона (последовательность tsaMBCD). Идентичные ферменты п-сульфобензоат (PSB) - диоксигеназных систем (psbAC) и терфталат (TER) - диоксигеназных систем (TerZabR) были обнаружены в двух независимо выделенных штаммах C. testosteroni, Т - 2 и PSB - 4 [201].
Штамм C. testosteroni BS1310, использованный в настоящей работе, выделен из активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений ПО "Новомосковскбытхим" г. Новомосковск Тульской области как деструктор бензолсульфоновой (БС) и п-толуолсульфоновой (TС) кислот [159].
В заключение по обзору литературы можно отметить, что имеются определенные преимущества при использовании биосенсоров на основе микробных клеток для экологического мониторинга. К ним относятся простота изготовления, надежность, более высокая рабочая стабильность, относительная дешевизна получения биоматериала. Актуальна проблема детекции сульфоароматических соединений, широко представленных в промышленных и бытовых сточных водах. В то же время в литературе отсутствуют данные по разработке биосенсоров для детекции сульфоароматических соединений на основе микроорганизмов, и описано относительно малое их количество для детекции фенола. Данное обстоятельство являлось определяющим при выборе цели исследования.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Исследование способности микроорганизмов к деградации толуолсульфоната (ТС)
В работе использован бактериальный штамм Comamonas testosteroni BS1310, содержащий плазмиду катаболизма бензолсульфоната и ТС (pBS1010), размером 130 тпн. C. testosteroni – почвенный микроорганизм, грамотрицательная палочка. Штамм выделен из активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений ПО “Новомосковскбытхим”, г. Новомосковск Тульской области, и предоставлен для исследования лабораторией биологии плазмид ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН. Культуру выращивали на минеральной среде E с ТС в качестве единственного источника углерода и энергии. В работе использовали п-толуолсульфонат натрия (TС) (Aldrich, USA, 95%), бактоагар (“TypUSA”, FERAK, Berlin (West)).
Полученные клетки отделяли центрифугированием, после чего промывали калий-фосфатным буфером. Осадок суспендировали в том же буфере и использовали в работе. Клетки иммобилизовали в 2%-ный агаровый гель при температуре 45оС. Полученный блок геля с иммобилизованными клетками гранулировали, продавливая через сито с размером ячеек 500 мкм. Гранулы агара с иммобилизованными клетками промывали буфером декантацией 3 – 5 раз в цилиндре объемом 250 мл, отбирая 1-минутную фракцию.
Трансформация TС иммобилизованными и свободными клетками изучалась в периодических условиях на качалке (200 об/ мин) при температуре 26оС. В колбы Эрленмейера объемом 750 мл помещали 80 мл буфера, содержащего 109 мг клеток (по сухому весу) и TС в конечной концентрации 1.25 мМ. Субстрат вносили в виде водного раствора. Из реакционной смеси через определенные промежутки времени отбирали аликвоты водной фазы, в которых определяли содержание TС.