Автор работы: Пользователь скрыл имя, 01 Марта 2013 в 14:24, диссертация
Цель исследования. Целью работы являлось создание биосенсоров электрохимического типа для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas, являющихся деструкторами п-толуолсульфоната и фенола, соответственно.
Список используемых сокращений 6
1. ВВЕДЕНИЕ 7
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Биосенсоры как направление
в аналитической биотехнологии 13
2.1. Типы преобразователей, используемые в
биосенсорах. Электрохимические преобразователи 14
2.2. Типы биологических материалов, применяемых в
рецепторных элементах биосенсоров 15
2.2.1. Сенсоры на основе ферментов, антител и
иммунных комплексов, ДНК, животных и
растительных клеток, клеточных органоидов 15
2.2.2. Сенсоры на основе микробных клеток 17
2.2.2.1. Микробные сенсоры в мониторинге газовых
и водных сред 19
2.2.2.1.1. Мониторинг атмосферы 19
2.2.2.1.2. Мониторинг гидросферы 20
2.2.2.2. Классы соединений, детектируемых с помощью
микробных биосенсоров 21
2.2.2.2.1. Определение БПК 21
2.2.2.2.2. Детекция мутагенов и поллютантов 25
2.2.2.2.3. Сенсоры для определения анионных
поверхностно-активных веществ (ПАВ) 28
2.2.2.3. Методы иммобилизации биологического
материала в рецепторном элементе сенсора 29
2.3. Микроорганизмы-деструкторы и их использование
в разработке биосенсоров для детекции токсичных
соединений 30
2.3.1. Микроорганизмы-деструкторы токсичных соединений 30
2.3.2. Методы направленной модификации
микроорганизмов для придания им деструктивных свойств 34
2.3.3. Плазмидная детерминированность генов биодеградации 35
2.4. Потребности в детекции ароматических и
сульфоароматических соединений 36
2.4.1. Ароматические соединений и их влияние на экосистемы 36
2.4.2. Краткая характеристика сульфоароматических
соединений 36
2.4.3. Возможный механизм биодеградации
толуолсульфоната (ТС) 37
2.5. Характеристика штамма Comamonas testosteroni 38
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
3.1. Изучение Исследование способности микроорганизмов
к деградации толуолсульфоната (ТС) 41
3.1.1. Трансформация ТС свободными клетками 41
3.1.2. Деградация ТС иммобилизованными клетками 42
3.1.3. Определение скорости ферментативной реакции клеток 42
3.1.4. Деградация ТС в непрерывных условиях 42
3.1.5. Контроль процесса деградации 43
3.1.6. Получение плазмидного и бесплазмидного варианта
штамма C. testosteroni 43
3.2. Разработка микробного сенсора для определения
п-толуолсульфоната 44
3.2.1. Среда культивирования 44
3.2.2. Иммобилизация микроорганизмов 44
3.2.3. Исследование деградирующей активности
микроорганизмов 44
3.3. Разработка микробного сенсора для детекции фенола 45
3.3.1. Объект исследования 45
3.3.2. Штаммы-деструкторы фенола 46
3.3.3. Иммобилизация клеток 46
3.3.4. Хранение беактериальных штаммов 47
3.3.5. Скорость окисления субстрата
бактериальными клетками 47
3.4. Характеристика полярографической измерительной
системы 48
3.5. Деградация фенола в колоночном реакторе с
иммобилизованным активным илом установки
биохимочистки (БХО) 49
3.5.1. Отбор проб активного ила 49
3.5.2. Иммобилизация активного ила 49
3.5.3. Условия эксперимента 49
3.5.4. Контроль на входе и выходе колонки 49
3.5.5. Данные по работе установки биохимочистки 49
3.5.6. Определение фенола 50
3.6. Оптимизация работы установки БХО 50
3.6.1. Концентрация растворенного кислорода 50
3.6.2. Проведение замеров 50
3.7. Статистическая обработка полученных результатов 50
3.8. Основные технические параметры анализатора 50
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 51
4.1. Биодеградация ТС с помощью
C.testosteroni BS1310(pBS1010) 52
4.1.1. Деградация ТС свободными и иммобилизованными
клетками в периодических условиях 52
4.1.2. Деградация ТС в непрерывных условиях 54
4.2. Сенсор для детекции п-толуолсульфоната (ТС) 57
4.2.1. Скрининг штаммов-деструкторов арилсульфонатов 57
4.2.2. Характеристика штамма Comamonas testosteroni 57
4.2.3. Характеристика сенсоров на основе
плазмидсодержащего и бесплазмидного штамма C. testosteroni 58
4.2.4. Исследование работы сенсора на основе клеток
Comamonas testosteroni в проточной системе 76
4.3. Разработка микробного биосенсора для детекции
фенола 80
4.3.1.Скрининг штаммов-деструкторов фенола 80
4.3.2. Характеристика штамма 32-I
(Субстратная специфичность) 84
4.3.3. Характеристика сенсоров на основе
плазмидсодержащего и бесплазмидного вариантов
штамма 32-I 85
4.4. Возможные пути решения практических задач
с применением биосенсорного подхода 97
4.4.1. Деградация целевых соединений сточных вод
иммобилизованными на колонке микроорганизмами
установки биохимочистки сточных вод (БХО) 100
4.4.2. Использование полученных данных для оценки
эффективности процесса очистки стоков в аэротенках
установки биохимической очистки 106
4.4.2.1. Исходное состояние установки биохимочистки 106
4.4.2.2. Результаты проведенных технических и
технологических мероприятий на сооружениях БХО 111
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 116
6. ВЫВОДЫ 118
7. ЛИТЕРАТУРА 120
3.5.4. Контроль на входе и выходе колонки осуществлялся по фенолу. В качестве контроля (холостой пробы) использовалась колонка, заполненная активированным углем без микроорганизмов.
Скорость протока составляла 2 – 5 мин-1.
3.5.5. Данные по работе установки биохимочистки получены из журналов ежедневного контроля качества стоков в период с 1994 по 2002 год.
3.5.6. Фенол в пробах определяли титриметрически согласно методики [204]. Кислород определяли титриметрически по Винклеру согласно методики [205].
3.6. Оптимизация работы установки БХО
3.6.1. Концентрация растворенного кислорода измерялась прецизионным кислородомером фирмы Hanna Instruments HI 9143.
3.6.2. Замеры проводились по первому и второму коридору каждого аэротенка с интервалом по длине аэротенка 10 м в верхнем слое иловой смеси. Длина коридора составляет 39 м (округленно 40). Точки отбора лежали на продольной оси коридора.
3.7. Статистическую обработку результатов измерений проводили стандартным методом с использованием t – критерия Стьюдента. Кривые на графиках строились по средним значениям, полученным в результате не менее 5 экспериментов. Анализатор выполнял процедуры определения максимального значения сигнала и процедуру дифференцирования сигнала с погрешностью не выше 0.5 %.
3.8. Основные
технические параметры
Таблица № 1
Наименование |
Значение параметра |
Преобразователь электрохимического типа (полярографический электрод), имеющий диапазон рабочих токов при содержании кислорода в измеряемой среде 9 мг/л |
50 – 60 нА |
Величина темного тока, не более |
2% от тока в среде, содержащей 9 мг/л кислорода |
Тип измерения |
проточно-инжекционный |
Объем измеряемой пробы |
любой из диапазона 10 – 1000 мкл |
Время анализа одиночной пробы, не более |
3 мин |
Периодичность измерения проб |
15- 20 проб/час |
Рабочая температура, °C |
20 - 25 |
Возможность работы в стационарном и переносном вариантах |
предусмотрена |
Электропитание |
220 В переменного тока; предусмотрено питание от источника постоянного тока 12 В |
Энергообеспечение |
30 Вт |
Размеры, см |
20×20×15 |
Масса, кг |
не более 3 |
В задачи исследования входило на основании анализа литературных данных произвести подбор микроорганизмов-деструкторов сульфоароматических и фенольных соединений. Затем на основе выбранных штаммов сформировать рецепторные элементы сенсоров для детекции целевых веществ. Параллельно провести исследование параметров деградации указанных соединений, как на основе лабораторного штамма, так и с помощью реальных микроорганизмов, входящих в состав биоценоза активного ила. Произвести оценку, и по возможности, оптимизацию функционирования очистных сооружений с помощью биосенсорного подхода.
4.1. Биодеградация TС с помощью C. Testosteroni BS1310(pBS1010)
В работе использовался C. testosteroni BS1310 (pBS1010), использованный нами как биорецептор при формировании сенсора [147] для определения п-толуолсульфоната.
В качестве носителя использовался агар, который является широко применяемым в микробиологической практике препаратом. Водные растворы, содержащие 1.5 - 2% агара, образуют прочные гели, устойчивые в нейтральных растворах. Ранее этот носитель был использован как оптимальный [147] при формировании биосенсора для определения TС на основе C. testosteroni BS1310 (pBS1010).
На рис. 1 представлена динамика трансформации TС свободными и иммобилизованными клетками. Cкорость превращения TС иммобилизованными клетками была несколько ниже, чем свободными. Это, вероятно, может быть обусловлено, диффузионными затруднениями для субстрата в гранулах агарового геля (фактор эффективности составляет 0.8). Потеря активности клеток после иммобилизации может быть обусловлена диффузионными затруднениями для субстрата и/или кислорода в агаровой матрице.
4.1.1. Деградация TС свободными и иммобилизованными клетками в периодических условиях
Изучена кинетика деградации TС иммобилизованными и свободными клетками в периодических условиях при перемешивании. Полученные данные представлены на рис. 1. Следует отметить также, что свободные клетки раньше достигают более глубокой степени деградации по сравнению с иммобилизованными.
Показано, что трансформация п-
Таблица № 2. Потребление кислорода свободными и иммобилизованными клетками при деградации п-толуолсульфоната.
КЛЕТКИ |
Потребление О2, нмоль мин-1 мг-1.* |
Активность, нмоль мин-1 мг-1 | |
|
В присутствии TS |
Без TS | ||
СВОБОДНЫЕ |
13.1 |
1.5 |
6.5 |
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ |
8.5 |
0.9 |
4.2 |
Рис. 1. Динамика трансформации TС свободными и иммобилизованными клетками C. testosteroni в периодических условиях.
На кривой 1 показано изменение концентрации TС в течение эксперимента с иммобилизованными клетками. Наиболее активно TС разлагался в первые 8 часов эксперимента. В последующие часы концентрация TС оставалась практически неизменной на уровне 75 мкг/ мл. Это могло произойти вследствие исчерпания TС в среде или вследствие инактивации клеток.
На кривой 2 показана динамика уменьшения концентрации TС в эксперименте со свободными клетками. Концентрация TС достигла постоянного уровня в 50 мкг/ мл в течение 10 часов. Таким образом, можно видеть, что иммобилизованные клетки разлагают TС более быстро, а свободные – более полно, хотя и за большее время по сравнению с иммобилизованными.
Для исследования ферментативных реакций в клетках в открытых системах наиболее изучен проточный реактор с идеальным вытеснением. Этот тип реактора представляет собой объем, равномерно заполненный клетками, в который с постоянной скоростью подается раствор субстрата. При этом в стационарном состоянии устанавливается постоянный градиент субстрата и продукта реакции, который определяется скоростью протока вводимого субстрата.
4.1.2. Деградация TС в непрерывных условиях
Была изучена деградация TС иммобилизованными клетками C. testosteroni BS1310 в непрерывных условиях на колонке с непрерывной подачей субстрата. На рис. 2 представлены зависимости деградации TС и продуктивности процесса от удельной скорости протока через колонку (биореактор). Следует отметить, что максимумы кривых не связаны друг с другом и максимальная деградация TС соответствует удельной скорости протока 30 - 35/час, в то время как максимальная продуктивность наблюдалась при 40 - 50/час.
При оптимальных условиях реактор работал до 5 суток без потери активности, которая соответствовала 37 мкМ (7.6 мг TС)/мг клеток (с. в.). Вероятно, при низких скоростях протока концентрация кислорода, поступающего с протоком, становится лимитирующим фактором процесса деградации TС. При высоких концентрациях субстрата можно рекомендовать использование каскада из нескольких колонок, связанных друг с другом. На рис. 3 показана схема процесса деградации п-толуолсульфоната по мета-пути.
Таким образом, определены оптимальные
условия работы реактора, при которых
достигается максимальная активность
и производительность системы. В
работе [129] также использовался биореактор
по разложению п-толуолсульфоната С. testosteroni. Объем реактора
составлял 8.2 л, количество биомассы 20.8
г, из которых 23% активной. Производительность
реактора составила 198 мг C/л´ч. В работе [184] производительность реактора
составила 0.4 г/л´час и время непрерывной работы реактора
9 месяцев.
Рис. 2. Степень разложения п-толуолсульфоната и продуктивность иммобилизованных клеток C. testosteroni BS1310(pBS1010) на колонке в зависимости от скорости протока.
Рис. 3. Схема деградации п-толуолсульфоната по мета-пути.
4.2. Сенсор для детекции п-толуолсульфоната (TС)
4.2.1. Скрининг шатммов-деструкторов арилсульфонатов
Поиск штаммов-деструкторов арилсульфонатов представлялось наиболее эффективным произвести среди микроорганизмов, обитающих в активных илах очистных сооружений ввиду присутствия в стоках (как промышленных, так и бытовых) арилсульфонатов.
29 бактериальных штаммов
- деструкторов
4.2.2. Характеристика штамма Comamonas testosteroni
В работе использован бактериальный штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010), полученный из коллекции культур Лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН. Штамм выделен из активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений ПО «Новомосковскбытхим» г. Новомосковск Тульской области [159]. Способность штамма к разложению п-толуолсульфоната (далее TС) явилась критерием для его использования при создании биосенсора для детекции TС.
Было показано[159], что способность к биодеградации TС штаммом C. testosteroni детерминирована плазмидой.
4.2.3. Характеристика
сенсоров на основе
На рис. 4 показана калибровочная зависимость биосенсора, построенная для п-толуолсульфоната. Разработанный сенсор характеризовался высокой чувствительностью. Нижний предел детекции (определяемый как концентрация субстрата, ответ на которую вдвое превосходит значение относительной ошибки) составил величину ~5 мкМ. C целью подбора оптимального режима работы сенсора проводили исследование влияния на него различных внешних факторов.
Рис. 4. Калибровочная кривая сенсора на основе иммобилизованных клеток C. testosteroni BS1310 (pBS1010). Исследуемое вещество - п-толуолсульфонат.
Рис. 5. Зависимость величины ответа
микробного сенсора на основе иммобилизованных
клеток плазмидсодержащего штамма C. testosteroni BS1310 (pBS1010) от температуры.
Концентрация толуолсульфоната - 25 мкМ.
На рис. 5 показано влияние температуры на микробный сенсор. Максимальный ответ наблюдали при 35°С; при более высоких значениях температуры величина ответа падала, по-видимому, в связи с обратимой частичной инактивацией ферментных систем бактерий.
Оптимальной областью рН при использовании клеток C. testosteroni в данной модели представляется рН 7.6, что согласуется с рН-оптимумом роста использованного штамма [159].
Изучение зависимости ответов модели от концентрации NaCl (рис.6) показало, что максимальные ответы наблюдались в области 30 мМ раствора NaCl. Отметим, что сенсор на основе C. testosteroni BS1320 (субстрат сенсора - этанол) был менее чувствителен к концентрации солей, чем сенсор на основе исходного штамма (субстрат - п-толуолсульфонат). Возможное объяснение этого факта заключается в ингибировании высокими концентрациями солей систем активного транспорта сульфоароматических соединений. Для проверки этого предположения была получена зависимость ответа сенсора на основе плазмидсодержащего штамма для этанола в концентрации 10 мМ. Вид полученной кривой был сходен с таковым для ионной зависимости штамма C.testosteroni BS1320.
Рис. 6. Зависимость величины ответа сенсора на основе иммобилизованных клеток C. testosteroni от концентрации NaCl. 1 - штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010), субстрат - п-толуолсульфонат (25 мкМ), 2 - штамм C. testosteroni BS1320, субстрат - этанол (10 мМ), 3 - штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010), субстрат - этанол (10 мМ). Показатели разброса данных представляют собой стандартное отклонение результатов.
Рис. 7. Зависимость величины ответа микробных сенсоров на основе иммобилизованных клеток C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и элиминанта С. testosteroni BS1320 от концентрации клеток в агаре. 1 - штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010), субстрат - п-толуолсульфонат (25 мкМ), 2 - штамм C. testosteroni BS1320, субстрат - этанол (10 мМ). Показатели разброса данных представляют собой стандартное отклонение результатов.