Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comanonas и Pseudomonas - деструкторов n-толуолсульфона

 

Зависимость ответов  моделей от концентрации клеток в  биорецепторном элементе приведена на рис. 7. Для изученного штамма оптимальным объемным соотношением клетки/агар в рецепторе являлось значение 1/10 (30 мг/мл агара). Для бесплазмидного штамма оптимальное соотношение составило 10 мг/мл агара (калибровка по этанолу). Снижение величины ответа при более высоких концентрациях биомассы, по-видимому, объясняется недостатком О₂ в области рецепторного элемента вследствие интенсивного фонового дыхания клеток, что подтверждается снижением базового уровня сигнала электрода с иммобилизованными клетками. Более низкая оптимальная концентрация для бесплазмидного штамма объясняется, по-видимому, тем, что на окисление моля ТС потребляется 2 моля О₂, а на окисление моля этанола требуется 3 моля О₂.

Стабильность сенсора  изучали путем введения контрольных концентраций исследуемого вещества через определенные промежутки времени (4 раза/сут). Ответ сенсора сохранял постоянный уровень в течение двух недель. При хранении геля с включенными клетками C. testosteroni BS1310 при 4°С в течение 24 сут чувствительность рецепторных элементов не изменялась.

Сенсор на основе бактерий C. testosteroni BS1310 (pBS1010) обладал высокой специфичностью к п-толуолсульфонату, бензолсульфонату и катехолу (рис. 8).

 

Рис. 8. Субстратная специфичность сенсоров на основе плазмидного (   ) и бесплазмидного (  ) варианта C. testosteroni. Все субстраты вводили в концентрации 10 мМ:

1 – толуолсульфонат 2 – фенол 3 – салицилат 4 – бензоат 5 – бензолсульфонат 6 – сульфобензоат 7– катехол

8 – алкилбензолсульфонат 9 – арабиноза 10 – арабит 11 – глицерин 12 – этанол 13 – глюкоза 14 – ксилоза

15 - ксилит  16 - метанол 17 - сорбит 18 - цитрат 19 - ацетат 20 - сорбоза 21 – ДДС-Na

 

 

Высокая чувствительность сенсора к катехолу объясняется, по-видимому, тем, что это соединение является интермедиатом катаболизма сульфоароматических соединений (см. схему). Следует отметить, что биосенсор на основе бесплазмидного штамма C. testosteroni BS1320 был практически нечувствителен к сульфоароматике, так как не содержал плазмиды pBS1010. Его ответы на катехол и другие ароматические соединения были также невелики, в то время как чувствительность к углеводам, спиртам и органическим кислотам близка к таковой биосенсора на основе C. testosteroni BS1310 (pBS1010). Это обстоятельство позволяет сделать предположение о потенциальной эффективности дифференциальной системы детекции сульфоароматических соединений, включающей сенсоры на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов. Поскольку специфичность большинства микробных сенсоров невысока, представлялось полезным использование дифференциальной измерительной системы на основе двух штаммов, специфичность которых различается по небольшому числу субстратов. В этом случае сигнал на требуемое вещество при анализе сложной смеси определялся бы вычитанием сигналов обоих сенсоров.

Для проверки возможности  использования плазмидного и  бесплазмидного штамма в составе дифференциальной пары для детекции п-толуолсульфоната было проведено их сравнительное исследование. На основе полученных данных был произведен расчет эффективности сенсора на основе дифференциальной пары плазмидный – бесплазмидный штамм. Для этого были рассчитаны суммы сигналов, вызываемых нецелевыми веществами, у плазмидного и бесплазмидного варианта штамма.

При выполнении оценок предполагалось, что сигналы сенсора аддитивны, т.е. измерения проводятся в области линейной зависимости сигналов сенсора от концентрации данного соединения. Следует также отметить, что оценка получена для всех соединений, присутствующих в равной концентрации, составляющей 10 мМ.

Рис. 9. Субстратная специфичность  сенсоров на основе плазмидного     (   ) и бесплазмидного (   ) варианта C. testosteroni. Все субстраты вводили в концентрации 10 мМ:

1 – толуолсульфонат 2 – фенол 3 – салицилат 4 – бензоат 5 – бензолсульфонат 6 – сульфобензоат 7– катехол

8 – алкилбензолсульфонат 9 – арабиноза 10 – арабит 11 – глицерин 12 – этанол 13 – глюкоза 14 – ксилоза

15 - ксилит  16 - метанол 17 - сорбит 18 - цитрат 19 - ацетат 20 - сорбоза 21 – ДДС-Na

 

 

 

Таблица № 3. Анализ субстратной специфичности сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного варианта C. testosteroni.*

Исследуемое вещество	Величина сигнала сенсора на основе плазмидного штамма	Величина сигнала сенсора на основе бесплазмидного штамма	Разница величин сигналов сенсоров
1 – толуолсульфонат	0.017       18 – цитрат	0.17	0.153
9 – арабиноза	0.006	0.014	0.008
10 – арабит	0	0.085	0.085
11 – глицерин	0.037	0.036	-0.001
12 – этанол	0.049	0.02	-0.029
13 – глюкоза	0.029	0.036	-0.007
14 – ксилоза	0.007	0.0085	0.0015
15 - ксилит	0.009	0.014	0.005
16 - метанол	0.015	0.014	-0.001
17 - сорбит	0.019	0.014	-0.005
18 - цитрат	0.009	0.008	-0.001
19 - ацетат	0.068	0.046	-0.022
20 - сорбоза	0.009	0.0068	-0.0022
Суммарная разница			0.0373
Разница сигналов на целевое  вещество			0.153

*Примечание. Данные, представленные  в графе "Разница величин  сигналов сенсоров" приведена в виде диаграммы на рис. 10.

 

В таблице показаны результаты анализа сигналов сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного штаммов в ответ на введение целевого вещества и мешающих соединений.

Как видно из таблицы, суммарная погрешность сигнала (добавочный сигнал) от присутствия посторонних  веществ в пробе составляет 0.0373 нА/с. Разница величин сигналов на целевое вещество (п-толуолсульфонат) составляет 0.153 нА/с. То есть, величина погрешности (дополнительный сигнал) составляет 24% при наличии в среде мешающих веществ всех исследованных классов.

 

Рис. 10. Разница величин  сигналов сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного варианта штамма на п-толуолсульфонат и на мешающие соединения.

 

Предлагаемый сенсор на основе пары из плазмидного и  бесплазмидного варианта можно также использовать для определения общего количества сульфоароматических соединений, поскольку сенсор на основе плазмидного варианта реагировал не только на ТС, но и на другие сульфоароматические соединения. В таблице № 3 дан анализ субстратной специфичности с учетом присутствия в среде нескольких сульфоароматических соединений. Как видно из таблицы, все сульфоароматические соединения вызывали у сенсора на основе плазмидного варианта штамма значительно большие по амплитуде сигналы, чем у сенсора на основе бесплазмидного варианта.

 

Таблица № 4. Анализ субстратной специфичности сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного варианта C. testosteroni с учетом присутствия в среде измерения нескольких сульфоароматических соединений.

Исследуемое вещество	Величина сигнала сенсора на основе плазмидного штамма	Величина сигнала сенсора на основе бесплазмидного штамма	Разница величин сигналов сенсоров
1 – толуолсульфонат	0.017       18 – цитрат	0.17	0.153
2 – фенол	0.001	0.003	0.002
3 – салицилат	0.008	0.009	0.001
4 – бензоат	0.013	0.006	-0.007
5- бензолсульфонат	0.004	0.16	0.156
6 – сульфобензоат	0.005	0.037	0.032
7 – катехол	0.015	0.143	0.128
8 – алкилбензолсульфонат	0.007	0.019	0.012
9 – арабиноза	0.006	0.014	0.008
10 – арабит	0	0.085	0.085
11 – глицерин	0.037	0.036	-0.001
12 – этанол	0.049	0.02	-0.029
13 – глюкоза	0.029	0.036	-0.007
14 – ксилоза	0.007	0.0085	0.0015
15 – ксилит	0.009	0.014	0.005
16 – метанол	0.015	0.014	-0.001
17 – сорбит	0.019	0.014	-0.005
18 – цитрат	0.009	0.008	-0.001
19 - ацетат	0.068	0.046	-0.022
20 – сорбоза	0.009	0.0068	-0.0022
21- ДДС Na	0	0.009	0.009
Суммарная разница			0.1663
Разница величин сигналов на целевое вещество			0.351

 

Погрешность (добавочный сигнал) при определении общей  суммы сульфоароматических соединений в присутствии всех мешающих веществ  составляет 47%; в отсутствие катехола, но в присутствии всех остальных соединений – 11%. Такие результаты были достигнуты благодаря тому, что величины сигналов на некоторые мешающие вещества были выше у плазмидного варианта, а на некоторые – у бесплазмидного. Поэтому сигналы на мешающие вещества в целом несколько уравновешивали друг друга.  В связи с этим при использовании сенсора для мониторинга природных и сточных вод следует учитывать их специфику. При преобладающем присутствии в среде измерения сульфоароматических соединений, и наличии остальных соединений в меньших концентрациях, поправка будет очень малой, поскольку величина 11% получена для ситуации, когда все вещества присутствуют в среде в равной концентрации. В реальных сточных водах, как правило, преобладает какая-либо группа соединений, определенная спецификой производства. Поэтому можно предполагать, что при анализе специфических сточных вод, содержащих сульфоароматические соединения (например, сточные воды предприятий по производству ПАВ), величина погрешности измерения будет существенно ниже полученной нами в лабораторных условиях.

Результаты по величине полученных поправочных коэффициентов  приведены в таблице № 5.

 

Таблица № 5. Поправочные коэффициенты для расчета при анализе многокомпонентных смесей с использованием системы дифференциальной детекции на основе штамма Comamonas testosteroni BS1310(pBS1010).

Тип анализируемой смеси	В присутствии катехола	В отсутствие катехола
ТС – единственное сульфоароматическое соединение в смеси	108%	24%
Присутствует несколько  сульфоароматических соединений	47%	11%

 

Из таблицы видно, что  наиболее эффективно использование  сенсора будет для определения  общего количества сульфоароматических  соединений в смеси, в которой  катехол отсутствует или содержится в незначительном количестве.

В рамках данной работы было произведено сравнение характеристик клеток плазмидсодержащего штамма, выращенных на бензолсульфонате и толуолсульфонате. Их чувствительность к этим веществам достоверно не различалась (данные не представлены), что может служить косвенным подтверждением того, что деградация бензолсульфоната и п-толуолсульфоната осуществляется одним ферментом.

В заключение отметим, что  в данной работе была создана модель сенсора, позволяющего определять концентрацию п-толуолсульфоната с нижним пределом детекции около 5 мкМ. Это обстоятельство, в сочетании с высокой селективностью анализа, делает возможным использование разработанной модели в качестве прототипа промышленного анализатора арилсульфонатов. Чувствительность сенсора к ацетату, этанолу и глюкозе не следует рассматривать в качестве ожидаемой помехи для анализа, поскольку данные вещества не встречаются в промышленных сточных водах.

В литературе отсутствуют  сведения о работах по созданию микробного сенсора для определения сульфоароматических  соединений. Имеются данные экспериментов по исследованию субстратной специфичности штаммов Pseudomonas rathonis T, Pseudomonas sp. 2T/1, P. aeruginosa 1S, P. putida K, Achromobacter eurydice TK [206]. В них было показано отсутствие чувствительности к сульфоароматическим соединениям. Таким образом, штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010) обладает достаточной специфичностью для определения сульфоароматики, что и определило его пригодность для детекции сульфоароматических соединений.

Другой путь оптимизации  анализа может быть основан на свойстве клеток, состоящем в том, что одной из первых стадий деградации арилсульфонатов данной культурой является их десульфонирование с высвобождением сульфита. Таким образом, принципиально возможной схемой может быть формирование гибридного анализатора, включающего колоночный реактор с иммобилизованными клетками C. testosteroni BS1310 и биосенсор для детекции сульфита, аналог которого описан в работе [34]. Такой подход, хотя и связанный с некоторыми трудностями (необходимость оптимизации работы

реактора), позволил бы ограничить спектр детектируемых субстратов только сульфоароматическими соединениями.

4.2.4. Исследование  работы сенсора на основе клеток Comamonas testosteroni в проточной системе

Целью данного раздела  работы была проверка возможности использования разработанного сенсора для детекции ТС на основе плазмидсодержащего штамма Comamonas testosteroni в проточной системе. Данная постановка вопроса была связана с тем, что для детекции исследуемого вещества в реальных образцах сточных и природных вод зачастую необходимы приборы проточного типа, позволяющие производить измерения в непрерывном режиме.

Была сконструирована  модель сенсора на основе клеток C. testosteroni для детекции ТС в проточной системе. Исследования проводили с использованием дозатора, позволяющего вводить пробы строго определенного объема (70 мкл). При иммобилизации на ДЭАЭ-целлюлозе штамм С. testosteroni, обладающий капсулой, вымывался из носителя, в отличие от штамма, лишенного капсулы. Исходя из этого, можно сделать предположение о том, что бескапсульный вариант в большей степени способен к адгезии на поверхностях.

Ранее исследование кюветной системы показало, что при отсутствии перемешивания в кювете концентрация кислорода уменьшается по сравнению с исходной концентрацией в перемешиваемой кювете до 75%.В проточной системе таких эффектов не наблюдается.

Были исследованы параметры  работы системы в условиях протока  без микроорганизмов. А затем  эксперименты проводились в проточной  системе с иммобилизованными  в агаровом геле на поверхности электрода Кларка микроорганизмами. Наименьшая скорость, при которой было возможно проведение измерений, составляла 0.5 мл/ мин. Содержание кислорода при такой скорости составляло 50 - 55%, амплитуда ответа - 10 - 15% при концентрации ТС 10 мМ. Время прохождения пробы через рецепторную часть электрода при скорости 0.5 мл/ мин составляло 8.5 секунды. На более высоких скоростях протока амплитуда ответа была существенно ниже, а время отмывки короче. С учетом того, что время ответа электрода согласно паспортным данным составляет 90 с, оптимальным объемом пробы при данной скорости будет объем порядка 750 мкл (в 7 раз меньше объема стационарной кюветы). При таком объеме пробы можно будет получать ответы со значительной амплитудой.