Определение чистоты лекарственных средств химическими, физическими и физико-химическими методами анализа

 

ТЕМА 5.

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСТОТЫ  ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ АНАЛИЗА.

Цель работы: Изучить возможности и методические приемы использования УФ - спектрофотометрии и хроматографии для определения чистоты лекарственных средств.

5.1. Спектроскопические методы анализа основаны на избирательном поглощении электромагнитного излучения анализируемым веществом и служат для исследования строения, идентификации и количественного определения светопоглощающих соединений. Концентрацию поглощающего вещества определяют, измеряя интенсивность поглощения. Поглощение при определенной длине волны является информацией о качественном и количественном составе определяемого вещества и составляет аналитический сигнал.

Спектрофотометрический  анализ относится к молекулярному  абсорбционному анализу, т. е. анализу  основанному на поглощении света молекулами анализируемого вещества и сложными ионами в ультрафиолетовой (УФ), видимой и инфракрасной (ИК) областях спектра.

Спектрофотометрический  метод анализа основан на принципе — пропорциональной зависимости между светопоглощением,  концентрацией определяемых веществ и толщиной поглощающего слоя.

С помощью  спектрофотометрического анализа  можно определять малые количества вещества, например, содержание примесей не ниже 5 х 10^-5 % (спектрофометрически) при погрешности определения 1—3 %.

Испытания на чистоту  с использованием УФ-спектрофотометрии

В настоящее время это  широко используемый и доступный в приборном отношении метод. Изменения в характере спектра позволяет судить об изменениях вещества, так продукты разрушения поглощают в области, отличной от поглощения исследуемого вещества.

Примером может служить  определение примесей адреналона в  адреналине.

 Адреналина гидротартрат ((ФС 42 – 2310-98). Адреналон. Оптическая плотность 0,05% раствора препарата в 0,01 н.растворе соляной кислоты при 310 нм в кювете с толщиной слоя в 1 см не должна превышать 0,1.

Ацетилсалициловая кислота (ОФС 42-022007)

Определение примеси свободной салициловой  кислоты:

Испытуемый  раствор. Около 0,3 г субстанции (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 10 мл спирта 96 %, прибавляют 1 мл 0,2 % раствора квасцов железоаммониевых, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Стандартный раствор. Около 0,06 г (точная навеска) стандартного образца салициловой кислоты (стандарт ВР или аналогичного качества) помещают в мерную колбу вместимостью 1 00 мл, растворяют в спирте 96 %, доводят объем раствора спиртом 96 % до метки и перемешивают. К 1 мл полученного раствора прибавляют 39 мл спирта 96 %, 4 мл 0,2 % раствора железоаммониевых квасцов и количественно разбавляют водой до 1 00 мл.

Используют  свежеприготовленные растворы.

Измеряют  оптическую плотность испытуемого  и стандартного раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 520 нм в кювете с толщиной слоя 50 мм. Содержание салициловой кислоты свободной в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле.

В некоторых случаях содержание поглощающих примесей может быть установлены по величинам отношений поглощения при различных максимумах.

Примером может служить определение примесей в цианокобаламине, ретиноле ацетате, токофероле ацетате и в других ЛВ.

 

Цианокобаламин (ФС 42 – 2518-94). Посторонние примеси. Измеряют оптическую плотность (D) раствора препарата, приготовленного для количественного определения, в кювете с толщиной слоя 10 мм в максимумах поглощения при длинах волн 278 нм ± 2 нм, 361 км ±2 нм, 550 нм ±2 нм.

Отношение оптической плотности  при 361 нм к оптической плотности  при 550 нм должно быть от 3,15 до 3,40;

Отношение оптической плотности  при 361 нм к оптической плотности при 278 нм должно быть от 1,70 до 1,88;

 

5.2. Испытания на чистоту  ЛВ с использованием  хроматографических  методов анализа. 

Хроматография в различных ее вариантах  преимущественно предназначена  для разделения многокомпонентных  смесей.

5.2.1. Наиболее широко применяемым для испытаний на чистоту является хроматография в тонком слое (ТСХ).

Пластинки с тонким слоем  сорбента выпускаются промышленным способом: импортные типа «Мерк», «Силуфол»  или отечественные "Сорбфил", «Олафол» и др.  Выпускаются пластинки, содержащие в слое сорбента добавки неорганических люминофоров и позволяющие идентифицировать вещества в УФ-свете - Силуфол УФ 254 и Силуфол УФ 366 (числа показывают длину волны УФ-света в нм, которым следует облучать пластинку после хроматографирования исследуемых веществ). Размеры пластин различны 5x15;.10x10; 15x15; 20x20см; толщина слоя сорбента, как правило, равна 0,10-0,20 мм.

В основе разделения веществ  в ТСХ преимущественно лежат  процессы распределения и адсорбции.  Распределительная хроматография основана на непрерывном перераспределении хроматографируемых веществ между двумя фазами, одна из которых неподвижна. 

Подвижная фаза может  быть представлена одним или смесью нескольких растворителей (смесь растворителей  обычно называют системой растворителей). При выборе подвижной фазы исходят из полярности компонентов смеси и полярности растворителей. Обычно для веществ полярного характера рекомендуется подвижная фаза, содержащая смесь полярных растворителей, для неполярных веществ - обратная зависимость. Подвижная фаза не должна обладать слишком большой элюирущей способностью, т.к. в этом случае вещество будет двигаться вместе с фронтом подвижной фазы, но, с другой стороны, слишком слабый элюент задерживает движение вещества.

Анализ методом ТСХ включает следующие стадии:

• Подготовка пластинок с тонким слоем сорбента
• Подготовка подвижной фазы
• Подготовка камеры для хроматографирования
• Подготовка растворов анализируемого образца и "свидетелей"
• Нанесение проб подготовленных растворов на пластинку
• Процесс хроматографирования
• Обнаружение зон компонентов смеси на хроматограмме
• Анализ хроматограмм, заключение.  

В качестве свидетелей используют:  Государственные стандартные образцы (ГСО) и рабочие стандартные образцы (РС0).

ГСО выпускаются промышленностью в соответствии с требованиями фармакопейных статей, разработанных на эти вещества -стандарты. Они представляют собой эталонные образцы лекарственных веществ, максимально очищенных от примесей, с содержанием действующего вещества 100 %.

Если ГСО отсутствует, то применяют РСО, в качестве которого используют серийные лекарственные вещества, соответствующие требованиям фармакопейных статей.

  Нанесение проб подготовленных растворов на пластинку проводятся с помощью микрошприца, калиброванных микропипеток или капилляров. Объем наносимого раствора как правило 1-10 микролитров с содержанием вещества до I00-200мкг.

Обнаружение веществ  компонентов смеси на хроматограмме  проводится следующими способами:

1. По собственной окраске,  если вещество окрашено;

2. По флуоресценции  веществ при облучения пластин  УФ-светом.

На основе химических свойств:

3. По окраске пятен,  получаемых в результате реакций,  проходящих при обработке парами  или опрыскивания хроматограмм  какими-либо реагентами, образующими окрашенные соединения с исследуемыми веществами. 

ТСХ нашла применение в фармакопейном, внутриаптечном контроле качества лекарств, токсикологическом  анализе, при исследовании действующих  веществ лекарственного сырья растительного  и животного происхождения, в  научных исследованиях, связанных с поиском, созданием и стандартизацией новых лекарственных средств.

ТСХ широко используется в целях определения примесей в фармакопейных субстанциях.

Примеры. 

Левомицетин (ФС 42-0250-07, определение посторонних примесей методом ТСХ.

Испытуемый  раствор, 0,1 г субстанции растворяют в 10 мл ацетона.

Раствор сравнения. 0,5 мл раствор А разбавляют ацетоном до 100 мл.

На линию  старта пластинки со слоем силикагеля 60 Р₂54 наносят 20 мкл (200 мкг) испытуемого раствора, 20 мкл (1 мкг) и 10 мкл (0,5 мкг) раствора сравнения. Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, помещают в камеру со смесью хлороформ метанол вода (90:10:1) и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе и просматривают в УФ-свете при 254 нм.

Пятно посторонней  примеси на хроматограмме испытуемого  раствора по совокупности величины и интенсивности поглощения не должно превышать пятно на хроматограмме раствора сравнения (1 мкг) (не более 0,5 %). Допускается пятно на линии старта.

Суммарное содержание примесей должно быть не более 1,5 %.

Результаты испытания  считаются достоверными, если на хроматограмме  раствора сравнения (0,5 мкг) четко видно пятно.

Рибоксин (ФС 42-0275-07). Посторонние примеси. Испытание проводят методом ТСХ.

Испытуемый  раствор. 0,5 г субстанции растворяют в ацетоне и разбавляют ацетоном до 10 мл.

Раствор сравнения. 1 мл испытуемого раствора разбавляют ацетоном до 100 мл. 1 мл полученного раствора разбавляют ацетоном до 10 мл.

На линию  пластинки со слоем силикагеля 60 Р254 наносят 10 мкл (500 мкг) испытуемого  раствора, 10 мкл (0,5 мкг) и 5 мкл (0,25 мкг) раствора сравнения. Пластинку с нанесенными  пробами сушат на воздухе, помещают в камеру со смесью этилацетат - гексан (1:1) и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе и просматривают в УФ-свете при 254 нм.

Пятно посторонней  примеси на хроматограмме испытуемого  раствора по совокупности величины и интенсивности поглощения не должно превышать пятно на хроматограмме раствора сравнения (0,5 мкг) (не более 0,1 %).

Результаты  испытания считаются достоверными, если на хроматограмме раствора сравнения (0,25 мкг) четко видно пятно.

5.2.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография является вариантом  колоночной жидкостной хроматографии, в которой неподвижная фаза –  твердый сорбент, а подвижная  фаза – жидкость, подаваемая в колонку  под повышенным давлением 

Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным  способом разделения, препаративного выделения и проведения количественного  и качественного анализа нелетучих  термолабильных соединений как с  малой, так и с большой молекулярной массой.

Основным требованием  в методе является растворимость  исследуемых веществ в подвижной  фазе, а также свойство удерживаться неподвижной фазой

Основными узлами современного жидкостного хроматографа являются: насос высокого давления, дозатор, высокоэффективная колонка, детектор с регистрирующим устройством.

Современные жидкостные хроматографы могут быть снабжены микропроцессором и устройствами, с помощью которых  можно автоматически производить  ввод пробы, поддерживать условие хроматографического  процесса по заданной программе, автоматически оптимизировать условия разделения, проводить расчет количественного состава анализируемой смеси по одной или нескольким программам и проводить качественный анализ.

Насос высокого давления (до 200-500 атм) обеспечивает подачу элюента в колонку с заданной постоянной скоростью. 

Хроматографические колонки  из нержавеющей стали (или из стекла) длиной 10-25 см с внутренним диаметром 0,3-0,8 см (чаще 0,4-0,5 см) заполняются адсорбентом  с диаметром частиц 5-10мкм 

Плотная упаковка частиц адсорбента малого диаметра в колонке позволяет получить высокоэффективное хроматографическое разделение компонентов смеси. Температура хроматографических колонок может поддерживаться с точностью +/-0,1 град.С 

В качестве детекторов в  жидкостной хроматографии обычно используют спектрофотометрический детектор с переменной (190-900 нм) или фиксированной (чаще при 254 нм) длиной волны, рефрактометрический или флуориметрический детекторы. Могут быть использованы и другие детекторы, например ионизационно - пламенный, электрохимические, масс - спектрометрический и т. д.

Чаще других применяется  спектрофотометрический детектор. В  частности, в приборах серии "Милихром" он позволяет анализировать вещества, поглощающие УФ-излучение в области  длин волн 190-360 нм. Принцип его действия состоит в поочередном прохождении монохроматического пучка через рабочую кювету и кювету сравнения с последующей автоматической регистрацией интенсивности поглощения на ленте потенциометра. 

В качестве адсорбентов  чаще всего применяют силикагель с гидроксилированной поверхностью и силикагель с привитыми к поверхности различными функциональными группами, реже используются окись алюминия и полимерные адсорбенты. На практике обычно применяют готовые колонки.

При работе с колонками, заполненными силикагелем, в качестве элюента используют углеводороды, иногда с добавлением небольшого количества спирта или других растворителей.