Оксид азота и биоцидность фагоцитов крови и легких в патогенезе хронических обструктивных болезней легких

АКАДЕМИЯ  МЕДИЦИНСКИХ НАУК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НАУЧНЫЙ ЦЕНТР КЛИНИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ 

МЕДИЦИНЫ

МИНИСТЕРСТВО  ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НОВОСИБИРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ  МЕДИЦИНСКАЯ 

АКАДЕМИЯ

На  правах рукописи

ЮРКОВА

Наталья Юрьевна

 

ОКСИД АЗОТА  И БИОЦИДНОСТЬ ФАГОЦИТОВ 

КРОВИ И ЛЕГКИХ В ПАТОГЕНЕЗЕ ХРОНИЧЕСКИХ ОБСТРУКТИВНЫХ  БОЛЕЗНЕЙ ЛЕГКИХ

 

14.00.16 – патологическая  физиология

14.00.05 – внутренние  болезни

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

 

  

  Научные руководители:

  доктор  медицинских наук

  профессор Д.Д.Цырендоржиев

  Заслуженный  деятель науки РФ,

  академик  РАМН,

  доктор  медицинских наук,

  профессор Л.Д.Сидорова

 

Новосибирск 2002

ОГЛАВЛЕНИЕ

	стр.
ВВЕДЕНИЕ ………………………………….…………………….……	5
Глава 1. ОБЗОР  ЛИТЕРАТУРЫ ……………….……………………	12
Патогенетические аспекты  хронических обструктивных болезней легких……………………………………………………….………….…	12
1.1. Основные патогенетические  звенья хронических обструктивных  болезней легких …………….……………………………………...	15
1.1.1. Роль фагоцитов  крови и легких в патогенезе  хронических обструктивных болезней легких ……..……………………………...	19
1.1.2. Цитокины в патогенезе  воспаления при хронических обструктивных болезней легких ……………….………………………….	23
1.1.3. Роль прооксидантной  и антиоксидантной системы…………….	29
1.1.4. Значение оксида  азота…………………………………………….	35
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ  И МЕТОДЫ ………………………………	44
2.1. Материалы исследования………………………………………….	44
2.2. Методы исследования………………………………………………	46
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.	53
3.1. Клинико-биохимические  показатели крови больных хроническими обструктивными болезнями легких…………………………….	53
3.2. Потенциальная биоцидная  функция нейтрофилов крови и  фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких…………………………….	57
3.2.1. Спонтанный хемилюминисцентный  ответ……………………...	58
3.2.2. Зимозан-индуцированный  хемилюминисцентный ответ………	60
3.3. Влияние ингибитора L-аргинина на потенциальную биоцидную функцию нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких…………………..	62
3.3.1. Влияние ингибитора L-аргинина на продукцию активных метаболитов кислорода нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости …………………………………………..	62
3.3.2. Влияние ингибитора L-аргинина на зимозан-индуцированную продукцию активных метаболитов кислорода нейтрофилами крови и фагоцитами бронхоальвеолярной лаважной жидкости …………….	66
3.4. Содержание цитокинов:  интерлейкина-1, интерлейкина-4 и интерлейкина-6 в сыворотке крови и бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких………………………………………………………………………...	69
3.5. Содержание оксида  азота (NO) в сыворотке крови и бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких……………………………………	72
3.6. Корреляционные связи  между активностью окислительного  метаболизма нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости и содержанием оксида азота у больных хроническими обструктивными болезнями легких…………………………….	80
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ…..	86
ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………..	98
ВЫВОДЫ……………………………………………………………….	101
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………….	103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………….	104

 

 

 

 

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

 

АМК	- Активные метаболиты  кислорода
АТФ	- Аденозинтрифосфорная  кислота
БА	- Бронхиальная астма
БАВ	- Биологически-активные  вещества
ДНК	- Дезоксирибонуклеиновая  кислота
ИЛ-1 ИЛ-4 ИЛ-6	- Интерлейкин – 1 - Интерлейкин – 4 - Интерлейкин - 6
ИС	- Индекс стимуляции
ИКЧ	- Индекс курящего человека
ИХЛ	- Индуцированная хемилюминисценция
КД	- Ксантиндегидрогеназа
КО	- Ксантиноксидаза
NO	- Оксид азота
НАДФ+	- Никотинамидадениндинуклеотидфосфат
НАДН	- Восстановленная форма  никотинамидадениндинуклеотид
NGMA	- NG-монометил-L-аргинин
ОФВ1	- Объем форсированного  выдоха за первую секунду
ПОЛ	- Перикисное окисление  липидов
СХЛ	- Спонтанная хемилюминисценция
ХНБ	- Хронический необструктивный  бронхит
ХОБ	- Хронический обструктивный  бронхит
ХОБЛ	- Хронические обструктивные  болезни легких
ХЛ	- Хемилюминесценция

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В настоящее время медицинское и социально-экономическое значение хронических обструктивных болезней легких (ХОБЛ) чрезвычайно высоко, в первую очередь, из-за своей распространенности и высокой степени инвалидизации населения. В структуре заболеваемости органов дыхания ХОБЛ входит в число лидирующих патологий по числу дней нетрудоспособности и занимает четвертое-пятое место среди причин смерти (Сидорова Л.Д. и др. 1982, 1995, 2001; Чучалин А.Г., Шмелев Е.И., 1998, 2000; Standarts…, 1995).

На протяжении длительного  периода времени основная часть  научных исследований была направлена на изучение и детализацию органных, клеточных и патоморфологических изменений при хронических воспалительных процессах в легких. На основании этих исследований было создано несколько различных классификаций, что дало возможность выбора тактики лечения пациента при данной патологии и прогноза его дальнейшего выздоровления (Непомнящих Г.И., 1979; Авцын А.П. и др., 1982; Адо А.Д. и др., 1982; Барминская Г.В. и др., 1990; Сидорова Л.Д. и др., 1994; Непомнящих Г.И., Непомнящих Л.М., 1997).

При изучении развития воспалительного  процесса в легких важное значение придается исследованию функционального состояния ключевых клеток эффекторов воспаления – нейтрофилов и моноцитов/макрофагов (Маянский Д.Н., 1991; Чучалин А.Г., Шмелев Е.И., 1998, 2001; Thompson R., 1988; Anderson R. e.a., 1987; Slade R. e.a., 1993; Henderson W., 1994; Godaly G. e.a., 2001). Фагоцитирующие клетки крови относятся к числу наиболее реактивных клеток, отражающих любое отклонение в гомеостазе (Маянский А.Н., Галиулин А.Н., 1984;  Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Godaly G. e.a., 2001). При этом нейтрофилы и другие фагоцитирующие клетки секретируют в «окружающую среду» провоспалительные факторы с мощным деструктивно-биоцидным потенциалом (высокореактивные активные метаболиты кислорода, лизосомальные ферменты и пр.) оказывая, с одной стороны санацию очага воспаления, а с другой – деструктивное действие на ткани органа локализации патологического процесса (Маянский Д.Н., 1991; Зенков Н.К. и соавт., 2001).

В последнее десятилетие  интенсивно исследуется роль оксида азота (NO) в патогенезе болезней легких, в результате чего установлено его прямое бронходилатирующее действие (Holt P.G., 1995; Lin J., Seguin R., 2001).

Однако, несмотря на активное изучение роли оксида азота в патогенезе воспалительных процессов в легких, уделяется недостаточно внимания проблеме взаимоотношения ключевых клеток-эффекторов, являющихся продуцентами оксида азота в перифокальном воспалении с клеточными элементами собственно легочной ткани, которые также способны вырабатывать оксид азота. До сих пор слабо изучена роль оксида азота в развитии и хронизации воспалительного процесса дыхательных путей. Поскольку оксид азота обладает способностью к ионизации с образованием нитрита (NO ), нитрата (NO ), радикала NО и пероксинитрита (ONOO^-) эффекты его биологического действия становятся неоднозначными: от антиоксидантного до деструктивного воздействия. Учитывая вышеизложенное, исследование деструктивного потенциала фагоцитирующих клеток крови и легких, который может быть реализован  в тесной взаимосвязи их окислительного метаболизма с уровнем оксида азота при хронических обструктивных болезнях легких представлялось особо актуальным при изучении патогенеза данного заболевания.

Цель исследования: провести комплексное исследование взаимосвязи окислительного метаболизма нейтрофилов крови и фагоцитов легких с уровнем оксида азота для выявления особенностей течения хронических обструктивных болезней легких.

Задачи исследования:

1. Определить содержание  оксида азота в сыворотке крови  и в бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких.

2. Выявить взаимосвязь окислительного метаболизма нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости с оксидом азота при его ингибировании NG-монометил-L-аргинин у больных хроническими обструктивными болезнями легких in vitro.

2.1. Оценить окислительный  метаболизм нейтрофилов крови  и фагоцитов бронхоальвеолярной  лаважной жидкости при хронических  обтруктивных болезнях легких по степени генерации активных метаболитов кислорода.

2.2. Оценить влияние  ингибитора NG-монометил-L-аргинина на исходное состояние окислительного метаболизма нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости у больных хроническими обструктивными болезнями легких.

2.3. Оценить  влияние  ингибитора NG-монометил-L-аргинина на окислительный метаболизм при стимуляции зимозаном нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости.

3. Определить содержание  цитокинов: интерлейкина-1, интерлейкина-4 и интерлейкина-6 в сыворотке крови и в бронхоальвеолярной лаважной жидкости при хронических обструктивных болезнях легких.

Научная новизна  исследования. У больных хроническими обструктивными болезнями легких проведено комплексное сравнительное исследование кислород-зависимой биоцидности нейтрофилов крови и фагоцитов легких, определено содержание оксида азота и интерлейкинов -1, -4 и -6 в сыворотке крови и в бронхоальвеолярной лаважной жидкости, а также установлена взаимосвязь между генерацией активных метаболитов кислорода и содержанием оксида азота при использовании ингибитора L-аргинина, что позволило выявить новое звено патогенеза в формировании обструктивного компонента при хронических заболеваниях легких.

Установлено, что наименьшей способностью генерировать активные метаболиты кислорода обладали нейтрофилы крови и фагоциты легких больных хроническим обструктивным бронхитом, а наибольшей – больных хроническим необструктивным бронхитом и бронхиальной астмой в сочетании с хроническим обструктивным бронхитом, что может отражать роль недостаточности функциональной активности микро- и макрофагальной системы в патогенезе обструктивного синдрома.

Оценка резервных возможностей фагоцитирующих клеток крови и легких по значению индуцированного хемилюминесцентного  ответа на дополнительный стимул зимозана выявило их снижение у больных хроническим необструктивным бронхитом и повышение у больных бронхиальной астмой в сочетании  с хроническим обструктивным бронхитом, что в последнем случае свидетельствует о высокой готовности клеток к реализации своего цитотоксического (деструктивного) потенциала.

У больных хроническим  необструктивным бронхитом и  во всех группах больных хроническими обструктивными болезнями легких содержание интерлейкина-1, -4 и -6 в сыворотке крови превышали нормативные значения. Установлено, что содержание интерлейкина-1 и -4 в крови достоверно превышало нормативные показатели только у больных хроническим необструктивным и хроническим обструктивным бронхитом, что свидетельствует о преобладании иммунного компонента воспаления; достоверное повышение уровня интерлейкина-6 в сыворотке крови и в бронхоальвеолярной лаважной жидкости было выявлено у больных хроническим обструктивным бронхитом и бронхиальной астмой в сочетании с хроническим обструктивным бронхитом. Полученные результаты могут служить дифференциально-диагностическими критериями для понимания природы воспалительного процесса у больных с данными заболеваниями.

Впервые показано, что  у больных хроническим обструктивным  бронхитом и бронхиальной астмой в сочетании с хроническим обструктивным бронхитом с повышенным уровнем иммуноглобулина Е отмечается преимущественное, по сравнению с сывороткой крови, снижение содержания оксида азота в бронхоальвеолярной жидкости и снижение параметров объема форсированного выдоха за первую секунду у данной категории больных, что может быть расценено как преобладание атопического компонента воспаления при данной патологии и потенцирование развития бронхиальной обструкции.

Впервые показано, что  культивирование нейтрофилов крови  и фагоцитов легких с ингибитором L-аргинина, приводит к повышению ими генерации активных метаболитов кислорода. При этом выявлено, что у больных хроническими обструктивными болезнями легких при культивировании с ингибитором L-аргинина способность нейтрофилов крови вырабатывать активные метаболиты кислорода была выше, чем у фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости. Показано, что при дополнительной стимуляции клеток после их культивирования с ингибитором L-аргинина у больных хроническими обструктивными болезнями легких, кроме группы больных хроническим необструктивным бронхитом, наблюдалась тенденция увеличения зимозан-индуцированного хемилюминесцентного ответа нейтрофилов крови, тогда как хемилюминесцентный ответ фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости, напротив, снижался достоверно только у больных бронхиальной астмой в сочетании с хроническим обструктивным бронхитом, что подтверждает роль оксида азота в поддержании кислородного гомеостаза при изучаемых нозологиях.

Практическая  значимость. Результаты диссертации расширяют существующие представления о роли активных метаболитов кислорода и оксида азота в патогенезе и течении хронического воспалительного процесса при хронических обструктивных болезнях легких. Дано теоретическое обоснование внутриклеточных механизмов взаимосвязи генерации активных метаболитов кислорода с образованием оксида азота в фагоцитирующих клетках при хронических обсруктивных болезнях легких.