Оксид азота и биоцидность фагоцитов крови и легких в патогенезе хронических обструктивных болезней легких

В группе БА в сочетании с ХНБ значения и-ХЛ ответа фагоцитов в среднем составили 2,99±0,47 имп/клетка/мин, что было недостоверно выше показателей в группе ХНБ. У больных БА в сочетании с ХОБ зимозановая стимуляция фагоцитов БАЛ жидкости вызывала в среднем максимальный и-ХЛ ответ (5,96±1,19 имп/клетка/мин). Однако это значение было недостоверным по сравнению с показателями у больных ХНБ за счет высокой вариабельности значений и-ХЛ ответа фагоцитов БАЛ жидкости.

Таким образом, наименьшие значения и-ХЛ ответа нейтрофилов крови были выявлены у больных ХНБ, а максимальный ответ – у больных БА в сочетании с ХОБ. Максимальный и-ХЛ ответ нейтрофилов на дополнительный стимул (зимозан) у больных БА в сочетании с ХОБ свидетельствует о высокой готовности клеток к реализации своего цитотоксического (деструктивного) потенциала. Такая же тенденция в изменениях и-ХЛ ответа отмечается у фагоцитов БАЛ жидкости больных ХОБЛ.

 

3.3. Влияние  ингибитора L-аргинина на потенциальную биоцидную функцию нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости больных ХОБЛ и ХНБ

Активные метаболиты кислорода и оксид азота вырабатываются нейтрофилом и могут быть как оксидантами – АМК, так и занимать двойственное положение – NO (т.е. быть прооксидантом и антиоксидантом). При ингибировании L-аргинина, ключевого индуктора выработки оксида азота антиметаболитом NG-монометилом-L-аргинин (NGMA) в лабораторных условиях нейтрофил отвечал достоверным изменением выработки АМК (Nakamura L.T., Wu-Hsceih B.A., 1998).

 

3.3.1. Влияние ингибитора L-аргинина на продукцию АМК нейтрофилами крови и фагоцитами БАЛ жидкости

В таблице 8 представлены результаты потенциальной биоцидной  активности нейтрофилов крови (- NGMA) и результаты при использовании ингибитора L-аргинина (+ NGMA).

 

 

 

Таблица 8

Влияние ингибитора L-аргинина на ХЛ ответ нейтрофилов крови больных ХНБ и ХОБЛ (М±m)

Группы больных	n	Imax ХЛ ответа (имп/Нф/мин)
		- NGMA	+ NGMA
ХНБ	16	0,011±0,003	0,62±0,091*
ХОБ	13	0,007±0,001	1,20±0,47*
БА в сочетании с ХНБ	14	0,011±0,002	1,67±0,88*
БА в сочетании с ХОБ	17	0,013±0,003	1,15±0,45*

Примечание: n – количество обследованных больных; * - Р<0,05 по сравнению с результатами потенциальной биоцидности нейтрофилов.

 

Как видно из таблицы 8, при использовании NGMA продукция АМК нейтрофилами крови больных ХНБ и ХОБЛ достоверно увеличивается (P<0,05).

Так, в группе больных  ХНБ, продукция АМК нейтрофилами крови при культивировании с NGMA возросла в 56 раз, ХОБ – в 171 раз (!), в группе БА в сочетании с ХНБ – в 151 раз (!), а в группе БА в сочетании с ХОБ увеличение произошло в 88 раз.

  На рисунке 2 представлены результаты хемилюминесцентного ответа фагоцитов БАЛ жидкости при культивировании с ингибитором L-аргинина (+NGMA) и без него (-NGMA).

 Рисунок 2. Влияние ингибитора L-аргинина на ХЛ ответ фагоцитов БАЛ жидкости больных ХОБЛ (М±m);

* - Р<0,05 по сравнению  с результатами ХЛ ответа без  ингибитора                 L-аргинина.

 

Как видно из рисунка, при использовании NGMA продукция АМК фагоцитами БАЛ жидкости больных ХНБ, ХОБ, БА в сочетании с ХНБ и БА в сочетании с ХОБ в среднем составила 0,59±0,05, 0,65±0,13, 0,56±0,03 и 0,57±0,05 имп/клетка/мин, соответственно, что было кроме группы ХНБ, достоверно выше (P<0,05) исходных значений без ингибитора L-аргинина. Так, продукция АМК фагоцитами БАЛ жидкости больных ХНБ при культивировании с NGMA возросла в 1,84 раза, у больных ХОБ – в 9,2 раза, БА в сочетании с ХНБ – в 3,7 раза, а в группе БА в сочетании с ХОБ увеличение произошло в 2 раза.

На рисунке 3 приведены результаты сравнительного анализа данных ХЛ ответа нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости больных ХНБ и ХОБЛ при их культивировании с ингибитором L-аргинина NGMA.

Рисунок 3. Абсолютные значения показателей ХЛ ответа нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости больных ХНБ и ХОБЛ при культивировании с ингибитором L- аргинина NGMA.

 

Как видно из рисунка, в группе больных ХНБ показатели АМК генерирующей способности нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости практически были равнозначны. В то же время у больных ХОБЛ при культивировании с ингибитором L-аргинина NGMA отмечалось повышение уровня продукции АМК нейтрофилами крови по сравнению с фагоцитами БАЛ жидкости.

Таким образом, культивирование  нейтрофилов крови и фагоцитов  БАЛ жидкости больных ХНБ и ХОБЛ с ингибитором L-аргинина выявило значительное увеличение ими продукции АМК. При этом было показано, что у больных ХОБЛ АМК генерирующая способность нейтрофилов крови была выше, чем у фагоцитов БАЛ жидкости.

 

3.3.2. Влияние  ингибитора L-аргинина на зимозан-индуцированную продукцию АМК нейтрофилами крови и фагоцитами БАЛ жидкости

На рисунке 4 представлены результаты зимозан-индуцированного  ХЛ ответа нейтрофилов крови при их культивировании с ингибитором L-аргинина.

 Рисунок 4. Влияние ингибитора NG-монометил-L-аргинина на зимозан-индуцированный ХЛ ответ нейтрофилов крови больных ХНБ и ХОБЛ.

 

Как видно из рисунка 4, при культивировании нейтрофилов  крови больных ХНБ с NG-монометил-L-аргинином среднее значение зимозан-индуцированного ХЛ ответа составило 0,58±0,09 имп/Нф/мин, что практически не отличалось от данного значения без ингибитора L-аргинина (0,66±0,06 имп/Нф/мин).

В группах больных  ХОБ, БА в сочетании с ХНБ и БА в сочетании с ХОБ, напротив, наблюдался недостоверный рост зимозан-индуцированного ХЛ ответа при культивировании с ингибитором L-аргинина (Рис. 4).

На рисунке 5 представлены результаты зимозан-индуцированного  ХЛ ответа фагоцитов БАЛ жидкости при их культивировании с ингибитором                NG-монометил-L-аргинином.

 Рисунок 5. Влияние ингибитора L-аргинина на зимозан-индуцированный ХЛ ответ фагоцитов БАЛ жидкости больных ХНБ и ХОБЛ.

 

Как видно из рисунка, при культивировании зимозан-индуцированных фагоцитов БАЛ жидкости больных ХНБ, ХОБ, БА в сочетании с ХНБ и БА в сочетании с ХОБ с NG-монометил-L-аргинином, их ХЛ ответ в среднем составил 0,55±0,08, 0,64±0,09, 0,61±0,11 и 0,47±0,055 имп/клетка/мин, соответственно.

При этом, только у больных  БА в сочетании с ХОБ значение данного показателя было достоверно ниже в 1,9 раза (P<0,05),  по сравнению с клетками, культивированными без ингибитора L-аргинина. А результаты данного исследования у больных ХНБ и БА в сочетании с ХНБ были недостоверными, поскольку вариабельность зимозан-индуцированного ХЛ ответа фагоцитов БАЛ жидкости у этих групп была значительной.

 На рисунке 6 приведены результаты сравнительного анализа данных зимозан-индуцированного ХЛ ответа нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости больных ХНБ и ХОБЛ при их культивировании с ингибитором NG-монометил-L-аргинином.

  Рисунок 6. Абсолютные значения показателей зимозан-индуцированного ХЛ ответа нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости больных ХНБ и ХОБЛ при культивировании с ингибитором L-аргинина.

 

Как видно из рисунка, в группе больных ХНБ показатели зимозан-индуцированной продукции АМК нейтрофилами крови и фагоцитами БАЛ жидкости были практически равнозначными. В то же время у больных ХОБЛ при культивировании с ингибитором L-аргинина отмечалось повышение уровня зимозан-индуцированной продукции АМК нейтрофилами крови по сравнению с фагоцитами БАЛ жидкости. Так, в группах ХОБ, БА в сочетании с ХНБ и БА в сочетании с ХОБ зимозан-индуцированная продукция АМК нейтрофилами крови достоверно увеличивалась (P<0,05) по сравнению с зимозан-индуцированной генерацией АМК фагоцитами БАЛ жидкости, соответственно, в 4,48 раз, 3,6 и 2,74 раза. При этом, максимальные значения данного показателя наблюдались в группе больных ХОБ.

Таким образом, при культивировании зимозан-индуцированных нейтрофилов крови с ингибитором NG-монометил-L-аргинином наблюдалась тенденция увеличения ХЛ ответа у больных ХОБЛ, кроме группы больных ХНБ, тогда как ХЛ ответ фагоцитов БАЛ жидкости, напротив, снижался. Однако, изменение показателей при данном исследовании у нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости, обследованных групп больных не было достоверным, кроме достоверного снижения зимозан-индуцированного ХЛ ответа фагоцитов БАЛ жидкости больных БА в сочетании с ХОБ (P<0,05).

 

3.4. Содержание  цитокинов: интерлейкина-1, интерлейкина-4 и интерлейкина-6 в сыворотке крови и БАЛ жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких и больных хроническим необструктивным бронхитом

Среди молекул, регулирующих функции нейтрофилов, в последнее время пристальное внимание привлекают эндогенные медиаторы – цитокины (Гарбузенко Т. С., Потапнев М. Н., 1995). При стрессе и патологических состояниях (антигенное воздействие, микробная инвазия, воспаление, повреждение тканей, развитие опухолей) расширяется количественный и качественный состав цитокинов, обладающих как местной (ауто- и паракринная), так и дистантной (гормональная в собственном смысле этого слова) регуляторной активностью.

Таким образом, с учетом вышеизложенного, было проведено исследование цитокинового профиля (интерлейкинового) в сыворотке крови и БАЛ жидкости больных ХНБ и ХОБЛ.

В таблице 9 представлены результаты исследования содержания цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-4 и ИЛ-6 в сыворотке крови больных ХНБ и ХОБЛ.

Таблица 9

Показатели цитокинов ИЛ-1, ИЛ-4 и ИЛ-6 в сыворотке крови больных ХНБ и ХОБЛ (М±m)

Группы больных	n	Интерлейкины (Ед/л)
		ИЛ-1	ИЛ-4	ИЛ-6
Контроль	10	58,4±9,41	3,2±0,57	1,7±0,3
ХНБ	16	655,98±102,77*	34,87±6,27*	8,51±1,7*
ХОБ	13	440,87±74,54*	24,45±3,67*	9,74±1,36*
БА в сочетании с ХНБ	17	813,67±71,47*	14,12±2,82*	5,99±0,89*
БА в сочетании с ХОБ	14	610,24±94,57*	4,06±0,77*	13,29±2,66*

Примечание: n – количество обследованных лиц; в контроле -здоровые доноры; * - Р<0,05 по сравнению с контролем.

 

Сравнение полученных результатов с контрольными цифрами показало, что у всех больных ХНБ и ХОБЛ содержание ИЛ-1 в сыворотке крови было значительно выше, чем в контроле. Так, у больных ХНБ, ХОБ, БА в сочетании с ХНБ и БА в сочетании с ХОБ содержание ИЛ-1 превышало контрольные показатели, соответственно, в 11,3 раза, в 7,55 раза, 13,9 раза и 10,4 раза (во всех случаях P<0,05).

Несколько иная картина  была выявлена при определении содержания      ИЛ-4 и ИЛ-6 в сыворотке крови  больных ХНБ и ХОБЛ. Содержание ИЛ-4 в сыворотке крови больных ХНБ и ХОБ достоверно (P<0,05) превышало контрольные цифры, соответственно, в 10,9 раза и 7,7 раза. В сыворотке крови больных БА в сочетании с ХНБ и БА в сочетании с ХОБ уровень содержания ИЛ-4, соответственно, был выше контрольных цифр в 4,4 и 1,3 раза, результаты были так же достоверными (P<0,05).

Содержание ИЛ-6 в сыворотке  крови больных ХНБ, ХОБ, БА в сочетании  с ХНБ и БА в сочетании с ХОБ превышало контрольные цифры, соответственно, в 5,0, 5,73, 3,5 и 7,8 раза. Все полученные результаты были достоверными (соответственно, P<0,05).

В БАЛ жидкости больных  ХНБ и ХОБЛ было определено содержание ИЛ-6 – ключевого цитокина, регулирующего  дифференцировку В-лимфоцтов в  иммуноглобулин-секретирующие плазматические клетки и стимулирующего синтез и секрецию острофазовых белков. Результаты определения ИЛ-6 в БАЛ жидкости больных ХНБ и ХОБЛ представлены в таблице 10.

Таблица 10

Содержание цитокина ИЛ-6 в БАЛ жидкости больных ХНБ  и ХОБЛ (М±m)

Группы больных	n	ИЛ-6 (Ед/л)
ХНБ	16	0,06±0,01
ХОБ	13	48,24±9,65*
БА в сочетании с ХНБ	17	0,49±0,09*
БА в сочетании с ХОБ	14	54,24±10,58*

Примечание: n – количество обследованных больных; * - Р<0,05 по сравнению с группой ХНБ.

 

Как видно из таблицы 10 содержание ИЛ-6 в БАЛ жидкости больных ХНБ было минимальным, тогда как у больных БА+ХНБ, в меньшей степени, а у больных ХОБ и БА в сочетании с ХОБ значительно превышали показатели содержания данного цитокина у больных ХНБ.

Таким образом, содержание цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-4 и ИЛ-6) в сыворотке  крови больных ХНБ и ХОБЛ в различной степени выраженности превышало контрольные значения. Наиболее значимое повышение в сыворотке крови обследованных больных было выявлено в содержании ИЛ-1. При анализе результатов определения ИЛ-4 в сыворотке крови было отмечено достоверное увеличение только у больных ХНБ и ХОБ. Что касается уровня содержания ИЛ-6 в сыворотке крови и в БАЛ жидкости обследованных групп больных, то его уровень достоверно был повышен у больных ХОБ и БА в сочетании с ХОБ.

 

3.5. Содержание  оксида азота (NO) в сыворотке крови и в БАЛ жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких и больных хроническим необструктивным бронхитом