Оксид азота и биоцидность фагоцитов крови и легких в патогенезе хронических обструктивных болезней легких

У больных ХНБ ОФВ₁ составил ³80% от должной величины, а бронхиальная обструкция носила обратимый характер. Возраст пациентов ХНБ варьировал от 20 до 22 лет. Из 16 человек 44% составили женщины, 56% - мужчины. Средний возраст всех пациентов ХНБ составил 28,7±3,8 лет.

Истории болезни анализировались  по стандартной схеме, учитывались  сведения анамнеза болезни и жизни, уточнялся профессиональный анамнез. Оценивались результаты бронхологического и лабораторных исследований, показатели функции внешнего дыхания и данные рентгенологического исследования. Рентгенологически у 90% пациентов определялся пневмосклероз, у 83% - эмфизема легких. Клинически дыхательная недостаточность первой степени установлена 25%, второй степени – у 35%. У 89% пациентов проводилось цитологическое и бактериологическое исследование мокроты с выявлением возможного возбудителя. При бактериологическом исследовании мокроты в диагностическом титре (10⁶) и (10³) в промывных водах бронхов выделялись Str. viridans (12%), Str. pneumoniae (11,5%) и рост непатогенной микрофлоры (15,8%). По характеру воспалительного процесса при проведении брохоскопического исследования у 29% больных диагностирован катаральный эндобронхит; у 30% больных катарально-гнойный эндобронхит; в 41% диагностирован атрофический эндобронхит. Наболее часто у пациентов ХОБЛ отмечалась слизистая (80%) или слизисто-гнойная мокрота (65%).

Особое значение при  анализе анамнестических данных придавали табакокурению. Из 44 пациентов 29 являлись курильщиками, что составило 48% от общего числа пациентов, 8% от общего количества курящих пациентов были женщины. Стаж курения от 2-х до 40 лет, ежесуточное количество сигарет от 10 до 40 штук.

Оценив данные пациентов, которые курят, по формуле индекса  курящего человека (ИКЧ) и формуле  анамнеза курения было выявлено, что 21% больных являются «злостными курильщиками».

Всем больным ХОБЛ и ХНБ проводилось комплексное бронхологическое исследование, включающее в себя диагностическую и лечебную фибробронхоскопию, с эндобронхиальным введением лекарственных препаратов.

Забор крови и бронхоальвеолярной лаважной (БАЛ) жидкости осуществлялся при проведении фибробронхоскопии на 5-6 сутки после поступления в стационар. У каждого обследуемого больного бралась венозная кровь с гепарином (10 ЕД/мл) для оценки окислительно-метаболической функции нейтрофилов крови и их реактивности.

Все больные ХОБЛ были разделены на группы по следующиму критерию:

А. По величине ОФВ₁:

• В первую группу вошли больные хроническим обструктивным бронхитом. Параметры ОФВ₁ - ≥ 70 %, бронхиальная обструкция носит необратимый характер. ХОБ средней и тяжелой степени тяжести отмечался более чем в 90% всех случаев, у мужчин преобладал ХОБ тяжелой степени практически в половине всех случаев, а среди женщин отмечалось равное распределение его по степеням тяжести.
• Во вторую группу вошли больные бронхиальной астмой в  с хроническим необструктивным бронхитом. Параметры ОФВ₁ - 50 - 69 % от должных величин, бронхиальная обструкция носит необратимый характер.
• В третью группу вошли больные бронхиальной астмой в  с хроническим обструктивным бронхитом. Параметры ОФВ₁ - < 50 %, в с необратимой бронхиальной обструкцией.

У пациентов с бронхиальной астмой была констатирована средняя  и тяжелая степень заболевания, причем как среди женщин, так и мужчин превалировала тяжелая степень тяжести.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Получение  бронхоальвеолярной лаважной (БАЛ) жидкости. БАЛ жидкость получали при проведении фибробронхоскопии, при помощи фибробронхоскопа фирмы «Olympus» BF P-30 (Япония), под местной анестезией: проводилась стандартная премедикация, анестезия слизистых гортани 2% раствором лидокаина. После осмотра бронхов фибробронхоскоп устанавливался в устье правого сегментарного бронха в нижней доле (S – 8, 9, 10), в данном случае в 9 сегменте. Далее микроирригатор продвигался до устьев бронхов 5-6 порядка.

После визуального осмотра  трахеи и бронхов оценивали характер, степень выраженности и распространенности воспалительных изменений трахеобронхиального дерева. У всех обследованных в бронхах наблюдался хронический воспалительный процесс, носящий, преимущественно, диффузный характер. Преобладала умеренная степень выраженности воспалительного процесса: в 90% случаев был определен эндобронхит I степени; у 10% больных установлена II степень эндобронхита.

Среди всех обследованных  больных в 37% случаев по визуальной эндоскопической оценке архитектоники бронхиального дерева выставлен диагноз: деформирующий эндобронхит, во всех случаях деформация бронхиального дерева была диффузной.

Следующим этапом бронхологического  исследования было получение бронхиальных смывов путем аспирации бронхиального  содержимого из долевых и сегментарных ветвей бронхиального дерева.

В соответствии с рекомендациями рабочей группы по БАЛ Европейского Респираторного Общества, общепринятые правила предусматривают дробное 3-5 кратное введение 50 мл подогретого  до 37⁰C стерильного изотонического раствора хлорида натрия (общее количество 150-250 мл), после чего проводилась немедленная вакуум-аспирация в стерильную пластиковую или стеклянную силиконированную ареактивную емкость (200 мл). Инстилляция повторялась 3-5 раз. Объем инстиллированной жидкости составлял 150-250 мл, объем аспирированой жидкости составлял 50-100 мл.

Первая порция называется “бронхиальным смывом”, а остальные  являются собственно БАЛ жидкостью. Аспирация проводилась через биопсийный канал фиброскопа.

Для получения супернантанта БАЛ жидкости забирали 10 мл бронхоальвеолярной лаважной жидкости, центрифугировали на центрифуге ОПН-3 при 1500 об/мин в течение 10 мин. Супернантант отсасывали в количестве 1,5 мл, разливали в ареактивные пластиковые пробирки для изучения его флогогенной активности. БАЛ жидкость разливали по аликвотам и хранили в жидком азоте (Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., 1987) до исследования ее флогогенной активности, определения концентрации NO и содержания цитокинов.

2.2.2. Получение сыворотки крови. Для получения тестируемых сывороток производился забор венозной крови по стандартной методике, давали свернуться в течение 2 часов при комнатной температуре, затем охлаждали и центрифугировали на центрифуге ОПН-3 при 1500 об/мин в течение 10 мин. Сыворотку отсасывали, разливали по аликвотам и хранили в жидком азоте (Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., 1987) до изучения ее флогогенной активности, определения концентрации NO и содержания цитокинов.

2.2.3. Определение общего количества  лейкоцитов и лейкоформулы крови осуществляли стандартными гематологическими методами с использованием для подсчета общей клеточности камеры Горяева и подсчета лейкоформулы по мазкам крови, окрашенных по Романовскому-Гимза.

2.2.4. Оценка потенциальной и зимозан-индуцированной  окислительно-метаболической функции нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости методом хемилюминисцентного анализа. Для оценки способности нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости нарабатывать активные метаболиты кислорода использовали метод люминол-зависимой хемилюминисценции (Цырендоржиев Д.Д. и соавт., 1994; Tono-oka T. et al., 1983). Измерения интенсивности хемилюминисценции проводились на биохемилюминометре «Скиф-0301» (СКТБ «Наука», Красноярск, Россия). В качестве люминофора был использован очищенный препарат люминола                (5-амино-2,3-дигидрофталазиндион-1,4) («Serva», США). Люминол растворяли в диметилсульфоксиде (марки ХЧ) в концентрации 10^-3 М и до использования хранили в темноте при +2˚С. Непосредственно перед экспериментом в растворе Хэнкса готовили рабочее разведение 10^-4 М, чтобы конечная концентрация люминола в инкубате была 10^-5 М.

Для регистрации зимозан-индуцированного хемилюминесцентного ответа нейтрофилов крови в кюветы для исследования вносили: 0,1 мл гепаринизированной крови исследуемых лиц, 0,7 мл бесцветного раствора Хэнкса и 0,1 мл 0,1 мМ раствора люминола. Затем добавляли 0,1 мл суспензии зимозана в концентрации 10 мг/мл, а в случае регистрации спонтанного хемилюминесцентного ответа – 0,1 мл раствора Хэнкса без фенолового красного.

Для регистрации фонового свечения в ячейки хемилюминометра  помещали кювету с 0,9 мл раствора Хэнкса и 0,1 мл 0,1мМ люминола. Все измерения проводили в дуплете. Регистрация интенсивности свечения каждой пробы осуществлялась ежеминутно в течение 30 циклов (30 мин). Результаты оценивали в количестве импульсов испускаемых одним нейтрофилом в течение мин (имп/Нф/мин).

По такому же принципу исследовали хемилюминесцентный ответ  фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости, только вместо 0,1 мл гепаринизированной крови добавляли 0,1 мл супернантанта БАЛ жидкости. Результаты оценивали в количестве импульсов испускаемых одним фагоцитом в течение мин (имп/клетка/мин).

2.2.5. Определение биоцидной функции  нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости при использовании ингибитора L-аргинина (NGMA). Для оценки способности нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости нарабатывать активные метаболиты кислорода при использовании ингибитора L-аргинина использовали метод люминол-зависимой хемилюминисценции (Цырендоржиев Д.Д. и соавт., 1994). Измерения проводились повыше описанной методике. Для регистрации хемилюминесцентного ответа нейтрофилов крови в кюветы для исследования вносили: 0,1 мл гепаринизированной крови исследуемых лиц, 0,7 мл бесцветного раствора Хэнкса и 0,1 мл 0,1 мМ раствора люминола. Затем добавляли 0,1 мл ингибитора L-аргинина в концентрации 10^-3 М, а в случае регистрации спонтанного хемилюминесцентного ответа – 0,1 мл раствора Хэнкса без фенолового красного.

Для регистрации фонового свечения использовали методику описанную  выше. Результаты оценивали в количестве импульсов испускаемых одним  нейтрофилом в течение мин (имп/Нф/мин).

По такому же принципу исследовали хемилюминесцентный ответ  фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости, только вместо 0,1 мл гепаринизированной крови добавляли 0,1 мл супернантанта БАЛ жидкости. Результаты оценивали в количестве импульсов испускаемых одним фагоцитом в течение мин (имп/клетка/мин).

2.2.6. Определение зимозан-индуцированной продукции АМК нейтрофилами крови и фагоцитами бронхоальвеолярной лаважной жидкости при использовании ингибитора L-аргинина (NGMA). Для определения зимозан-индуцированной способности нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости нарабатывать активные метаболиты кислорода при использовании ингибитора L-аргинина использовали метод люминол-зависимой хемилюминисценции (Цырендоржиев Д.Д. и соавт., 1994). Измерения проводились повыше описанной методике. Для регистрации хемилюминесцентного ответа нейтрофилов крови в кюветы для исследования вносили: 0,1 мл гепаринизированной крови исследуемых лиц, 0,6 мл бесцветного раствора Хэнкса и 0,1 мл 0,1 мМ раствора люминола. Затем добавляли 0,1 мл ингибитора     L-аргинина в концентрации 10^-3 М и инкубировали в термостате при температуре 37⁰С в течение 15 мин (Цырендоржиев Д.Д. и соавт., 1997). Непосредственно перед загрузкой в хемилюминометр добавляли 0,1 мл суспензии зимозана в концентрации 10 мг/мл. В случае регистрации спонтанного хемилюминесцентного ответа – 0,2 мл раствора Хэнкса без фенолового красного.

Для регистрации фонового свечения использовали методику описанную  выше. Результаты оценивали в количестве импульсов испускаемых одним  нейтрофилом в течение мин (имп/Нф/мин).

По такому же принципу исследовали хемилюминесцентный ответ  фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости, только вместо 0,1 мл гепаринизированной крови добавляли 0,1 мл супернантанта БАЛ жидкости. Результаты оценивали в количестве импульсов испускаемых одним фагоцитом в течение мин (имп/клетка/мин).

2.2.7. Определение  концентрации NO в сыворотке крови и бронхоальвеолярной лаважной жидкости. Оценка уровня содержания NO в сыворотке крови и бронхоальвеолярной лаважной жидкости проводилась с помощью определения нитритов в крови и лаважной жидкости с помощью реакции Грисса. Содержание нитритов в сыворотке крови и бронхоальвеолярной лаважной жидкости определялось согласно методу, описанному Ignarro L.G., et al. (1987). При этом использовалась реакция диазотизации сульфановой кислоты нитритами в кислой среде, и затем их соединение с N-I-Ned. С этой целью использовался реактив Грисса, растворенный в 12% уксусной кислоте. Цветная реакция оценивалась спектрофотометрически при длине волны 538 нм. Единица измерения нитритов в крови – мМ/мл.

2.2.8. Определение  цитокинов: интерлейкина-1,    -4 и -6 в сыворотке крови и  бронхоальвеолярной лаважной жидкости выполнялось иммуноферментным методом с использованием реагентов ProCon («Протеиновый контур», С.-Петербург, Россия).

2.2.9. Определение иммуноглобулина Е в сыворотке крови и бронхоальвеолярной лаважной жидкости проводили иммуноферментным методом с помощью коммерческого набора (Россия).

2.3. Методы статистической обработки  данных.

Статистическая обработка  материала осуществлялась пакетом прикладных программ Excel-2000 на PC Pentium III с использованием средней арифметической ошибки средней, критерия Стьюдента и применением корреляционного анализа (Гончаров А., 1996; Додж М., Кайнет К., 1996). При этом достоверность результатов соответствовала P < 0,05.

2.4. Резюме

Данные исследования проводились с целью определения  потенциальной и индуцированной АМК генерирующей способности нейтрофилов  крови и фагоцитов БАЛ жидкости у лиц страдающих ХОБЛ, а так же существования взаимосвязи между активностью нейтрофилов крови и легких, содержанием оксида азота и определением цитокинового профиля у данной категории больных.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Клинико-биохимические  показатели крови больных хроническими обструктивными болезнями легких и больных хроническим необстуктивным бронхитом

В данной главе  представлены результаты исследования клинико-биохимических показателей периферической крови и БАЛ жидкости больных ХНБ и ХОБЛ.