Оксид азота и биоцидность фагоцитов крови и легких в патогенезе хронических обструктивных болезней легких

 

1.1.4. Значение оксида азота

В последнее десятилетие интенсивно исследуется роль NO в патогенезе болезней легких (Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., 2001; Slade R. e.a., 1993; Henderson W., 1994; Godaly G. e.a., 2001). NO (оксид азота) синтезируется из  L-аргинина под влиянием NO-синтаз (NOS) при участии кальция и калмодулина (Sing S., Ewans T. W., 1997). Известны 3 формы NOS: эндотелиальная, макрофагальная и нейронная (Singh S., Ewans T. W., 1997), которые ведут к локальному синтезу NO и определяют его влияние на респираторную систему.

NO, выделяемый эндотелиальными клетками, обладает сосудорасширяющим действием на уровне мелких артерий и артериол, регилируя сосудистое сопротивление (Radomski M. W. et al., 1987; Griffiths M. J.D. et al., 1994). При этом установлено, что гипоксия снижает синтез NO (Vallance P., Collier J., 1999).

NO ингибирует адгезию (Radomski M. W. et al., 1987), активацию и агрегацию тромбоцитов, препятствуя внутрисосудистому тромбообразованию (Azuma H. et al., 1986). NO обладает прямым бронходилатирующим действием (Lin J., Seguin R., 2001), а также нейтрализует бронхоконстрикторное влияние ацетилхолина. NO усиливает функцию реснитчатого аппарата и способствует стерилизации респираторного тракта. Способность альвеолярных макрофагов продуцировать NO играет важную роль в поддержании местного иммунного гомеостаза респираторного тракта (Holt P. G., 1995, Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., 2001).

NО является самым низкомолекулярным внутри- и межклеточным регулятором в живых системах. Наличие целого семейства NO-синтаз в организмах человека и животных свидетельствует о важности оксида азота в процессах жизнедеятельности (Якутова Э.Ш., Дремина Е.С., 1994).

NO-радикалы обладают широким спектром биологического действия. Однако при рассмотрении каждого конкретного действия обнаруживается, что NО^. как усиливает процессы ПОЛ в мембранах клеток и липопротеинах сыворотки, так и ингибирует их; вызывает расширение сосудов, но может вызывать и вазоконстрикцию, в частности при воспалении (Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., 2001); индуцирует апоптозную гибель клеток и оказывает защитный эффект в отношении апоптоза, индуцированного другими агентами (Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., 1997); модулирует развитие воспалительной реакции; ингибирует окислительное фосфорилирование в митохондриях и синтез АТФ, но оказывает защитный эффект в условиях гипоксии, являясь источником окислов азота, которые могут выступать донорами электронов для цитохромоксидазы (Bloch K.D., Wolfram J.R., 1995).

Оксид азота  обладает широким спектром биологического действия: он является важным нейромедиатором центральной и периферической нервных систем; идентифицирован с эндотелиальным фактором релаксации (endothelium-derived relaxing factor, EDRF) (KestenS Chapman K.R., 1996), расслабляющим гладкие мышцы, предотвращающим агрегацию тромбоцитов и адгезию нейтрофилов к эндотелию; его синтез фагоцитирующими клетками связывается с микробицидным и противоопухолевым действием, регуляцией (ингибированием) пролиферации лимфоцитов (Якутова Э.Ш., Дремина Е.С., 1994). Эндогенный NО^. - важный компонент кальциевого гомеостаза в клетках и, соответственно, активности Ca-зависимых протеиназ. Однако основной физиологической мишенью для NО^. считается гуанилатциклаза, активация которой при действии радикалов приводит к увеличению синтеза внутриклеточного мессенджера цГМФ (May G.R., Crook P., 1991).

Образование NО^. в организмах человека и животных происходит при ферментативном окислении L-аргинина и показано во многих клетках и тканях. Синтез NО^. осуществляется семейством уникальных цитохром-Р-450-подобных гемопротеинов – NO-синтаз, молекулы, которых содержат домены с редуктазной и оксигеназной активностью, в результате чего происходит      5-электронное окисление L-аргинина с образованием L-цитруллина и NО^. (Chartrain N.A., Geller D.A., Koty P.P., 1994). По характеру индукции и действия ферменты разделяются на два класса:

I - кальций- и кальмодулин-зависимые, конститутивно экспрессируемые физиологическими факторами или через рецепторы NO-синтазы, разделяемые на эндотелиальную (тип I) и нейрональную (III тип) изоформы, выявляются в нейтрофилах, эндотелиоцитах, нейронах, тромбоцитах и других клетках (Якутова Э.Ш., Дремина Е.С., 1994);

II - кальций-независимая, индуцибельно экспрессируемая цитокинами NО-синтаза (тип II) - найдена в макрофагах, гепатоцитах, фибробластах, миоцитах, её активность также выявляется в различных клеточных культурах и тканях (Fast D.J., Lynch R.C., 1991); при активации фермента синтез NО^. возрастает в десятки раз и максимальных значений достигает через часы (Горрен А.К.Ф., Майер Б., 1998).

Все 3 типа синтаз в качестве кофактора используют НАДФН, ФАД, ФМН  и, возможно, тетрагидробиоптерин; спектр катализируемых реакций также во многом схож; альтернативными субстратами-ингибиторами синтеза оксида азота для них являются N^G-производные аргинина (Горрен А.К.Ф., Майер Б., 1998).

Конститутивные NO-синтазы, выделяемые из клеток разных типов, во многом сходны между собой, но резко отличаются от индуцибельных изоферментов.

Нейрональная NO-синтаза представляет собой растворимый мономерный протеин с молекулярной массой около 150 кДа, в её состав входят по 1 молю ФАД, ФМН, тетрагидробиоптерина, каждая молекула содержит кальмодулин-связывающий центр, осуществляющий Са²⁺-зависимую регуляцию синтеза NО^. и атом железа, входящий в состав гемовой простетической группы (Siafakas N.M., et al., 1995); показана её существенная гомологичность цитохром-Р-450-редуктазе и наличие НАДФН-диафоразной активности, при этом последняя может быть использована в качестве маркёра для конститутивных NО-синтаз, хотя показано наличие ложноположительных результатов (Cifont M.G., Cironi, L., 1999).

NО-синтаза эндотелиоцитов  несколько отличается от нейрональной  изоформы фермента и представляет собой миристоилированный нерастворимый энзим с молекулярной массой около 135 кДа, при этом мутация сайта                     N-миристоилирования превращает эндотелиальную NО-синтазу из мембранного белка в цитозольный, что приводит к снижению внеклеточной продукции NО^. (Bogdan C., Vodovotz Y., 1998).

По последним данным, деление на 3 типа не является окончательным, ибо методом соматической гибридизации выявлено, что в геноме человека   (в 17 хромосоме) присутствуют 3 гена, кодирующие гомологичные, но не идентичные по аминокислотной последовательности NО-синтазы II типа (Colasanti M., Persichini T., 1995).

Специфические для разных тканей и  клеток NО-синтазы в настоящее  время достаточно хорошо изучены, определены их молекулярные массы, первичные структуры белков и нуклеотидные последовательности соответствующих генов, установлена хромосомная локализация генов, кодирующих NО-синтазы. Так, интрон-содержащий ген нейрональной изоформы локализован в единой позиции 12 хромосомы человека (регион 12q24.2-12q24.31) (Petty G., Murray J., 1996), ген эндотелиальной изоформы (тип III) - в 7 хромосоме в позиции             7q35-7q36 (Marsden P.A., Heng H.H.Q., 1993); напротив, ген индуцибельного изофермента расположен по обеим сторонам центромеры 17 хромосомы, в позиции 17cen-q11.2 (Pare P.D., et al., 1997).

Образование NО^. макрофагами стимулируется бактериальными липополисахаридами, а также лимфокинами Т-хелперных лимфоцитов - такими, как интерлейкины-1 и -2, интерферон-g или его комбинации с ФНО-a, ФНО-b, липидом А (Alvarez B., Rubbo H., 2001), при этом отмечается, что если генерация О и Н₂О₂ происходит через несколько минут после стимуляции клеток, то синтез NО возрастает через часы и ему предшествует синтез мРНК NO-синтазы (Lancaster T., Stead L., 2001).

Наличие индуцибельной NО-синтазы  не является прерогативой только фагоцитирующих клеток. Считается, что «синтез индуцибельной NО-синтазы в макрофагах и других клетках – основа неспецифической резистентности» (Standards…, 1997).

Существуют  интересные данные о том, что воспалительные цитокины могут действовать как триггеры, переключающие синтез NО с конститутивного на индуцибельный: интерферон-g, как и липополисахарид, дозо- и время-зависимо ингибировал продукцию оксида азота конститутивной NО-синтазой, одновременно вызывая классическую индукцию NО-синтазы II типа (Furlong, B., Henderson, A.H., 1987; Contrino J., Krause P.J., 1998).

Выявлено также необратимое  ингибирование активности NO-синтазы  оксидом азота, что позволило предположить наличие обратной (feedback) регуляции по конечному продукту; аналогичный феномен обнаружен также и в отношении эндотелиальной NО-синтазы (Chun S.Y., Eisenhauer K.M., 1995).

Особое внимание фокусируется на свойствах NО^. как антимикробной и противоопухолевой эффекторной системы мононуклеарных фагоцитов, активной против грибов, бактерий, вирусов (Moncаda, S., Palmer, 1991), паразитов (Odonnell V.B., Chumley P.H., 1997), опухолевых клеток (Archer S., 1993). Цитотоксическое действие NО^. проявляется в отношении как внеклеточных, так и внутриклеточных объектов и связывается с нитрозилированием железосерных групп в активных центрах ферментов, включая такие жизненно важные энзимы, как аконитаза в цикле Кребса, комплексы I и II митохондриальной цепи переноса электронов (НАДН: убихинон оксидоредуктаза, сукцинат: убихинон оксидоредуктаза) в опухолевых клетках или Fе-СОД в бактериях; антивирусный эффект NО^. опосредован ингибированием репликации вируса и проявляется на уровне синтеза ДНК (Mannick J.B., Asano K., 1994). Многие бактерии и микроорганизмы имеют достаточно эффективную защиту от О₂-, образующегося при активации НАДФН-оксидазы, главным элементом которой является Fе-СОД, поэтому считается, что наработка NО^. позволяет фагоцитам преодолеть данную систему защиты (Zinetti M., Fantuzzi G., 1995).

Микробицидное или цитотоксическое действие NO^. может во многом зависить от образования окислов азота: нитрита (NO ), нитрата (NO ); радикалов NО и пероксинитрита (ONOO^-). В физиологических условиях NО^. взаимодействует с молекулярным кислородом с образованием двуокиси азота, в водных растворах разлагающейся на анионы NО и NО (Lancaster T., Stead L., 2001).

NO и NO - достаточно эффективные окислители. Окислы азота могут ингибировать ДНК-лигазу, необходимую для восстановления целостности ДНК в процессах транскрипции и репарации. Радикалы NО , также как NО^., могут нитровать вторичные амины с образованием канцерогенных                                     N-нитрозосоединений (Archer S., 1993). Окислы азота могут вновь восстанавливаться до NО^. за счет наличия нитритредуктазной активности у гемсодержащих белков (гемоглобин, миоглобин, цитохромоксидаза, цитохром Р-450), в результате образуется своеобразный цикл окиси азота (Zinetti M., Fantuzzi G., 1995).

Высокой токсичностью обладает пероксинитрит, который образуется в реакции NO^. с супероксид-анионом: O + NO^.  ¾¾® ONOO^-

Анализ поглощения кислорода  и образования О , окислов азота и ОNОО^- альвеолярными макрофагами показал, что при стимуляции клеток форболмиристатацетатом повышается как поглощение кислорода, так и продукция О , NО , NО , ОNОО^-, однако синтез окислов азота наблюдался даже в отсутствие стимуляторов. Это позволяет предположить, что синтез NО^. необходим для создания микробицидного потенциала лёгких (Vogels M.T.E., 2000).

NО^. может служить источником возникновения не только пероксинитрита и ОН-радикала, но и синглетного кислорода, который образуется при взаимодействии оксида азота с перекисью водорода (но не с супероксид-анионом). Возможно, этим можно объяснить усиление токсичности NО^. перекисью водорода в отношении эндотелиоцитов и опухолевых клеток (О таким эффектом не обладал) (Zinetti M., Fantuzzi G., 1995). Кроме того, показано усиление перекисью водорода антиагрегационного действия оксида азота, которое не было обусловлено образованием пероксинитрита и не ингибировалось ловушками радикалов.

Цитотоксическое действие NО^., подобно эффекту других активированных форм кислорода, не ограничивается чужеродными клетками и может проявляться в отношении собственных клеток и тканей организма (Lancaster T., Stead L., 2001).

Результаты последних  исследований позволили сделать  предположение, что активация  NО-синтазы  может служить причиной гибели посредством  апоптоза макрофагов, их костномозговых предшественников, тимоцитов, клеток поджелудочной железы, миобластов скелетных мышц, клеток корковых нейронов, гладкомышечных клеток, фибробластов и клеток саркомы M5076 (Lancaster T., Stead L., 2001).

В последние годы накапливается  всё больше данных, свидетельствующих о наличии мРНК и белка индуцибельной NО-синтазы в мононуклеарах человека (Mannick J.B., Asano K., 1994).

Кроме того, NО^. ингибирует активацию нейтрофилов и фагоцитарную НАДФН-оксидазу, эффективно взаимодействует с О₂-, в результате чего снижается продукция Н₂О₂, ОН^., гипогалоидов (Горрен А.К.Ф.,  Майер Б., 1998). Поэтому синтез NО^. часто рассматривается как защитный механизм, направленный против цитотоксического действия фагоцитов, особенно в отношении эндотелия.

Синтез NО^. в эндотелиальных клетках индуцируется целым рядом физиологических стимуляторов и вазоактивных соединений; при этом базальный уровень продукции NО^. в артериях выше, чем в венах (Westenberger U., Thanner S., 2001).

Вообще эффект NО^. как соединения, обладающего способностью расслаблять гладкомышечную мускулатуру, универсален: NО^. любого происхождения действует на чрезвычайно широкий спектр мышц. Так, показано, что эндотелиальный и нейрональный  NО^. снимает бронхоспазм (Lancaster T., Stead L., 2001). Расслабляющий гладкомышечные клетки эффект NО^. реализуется через активацию растворимой гуанилатциклазы и повышение цГМФ, что в свою очередь приводит к снижению и внутриклеточного содержания кальция.

В физиологических  концентрациях NО^. выступает скорее как антиоксидант, который тормозит развитие радикальных окислительных реакций, связываясь со свободными и входящими в состав гема ионами Fе²⁺ и ингибируя разложение перекисей (реакция Фентона) (Well C., 1996); а также перехватывая радикалы RO (Westenberger U., Thanner S., 2001).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ  И МЕТОДЫ

2.1. Материал  исследования

В соответствии с целью  и задачами данного исследования, были обследованы больные, страдающие хроническими обструктивными болезнями легких и находящиеся на стационарном лечении в отделении пульмонологии Государственной Областной клинической больницы г. Новосибирска.

В исследование были включены 44 больных ХОБЛ, 16 – хроническим  необструктивным бронхитом (ХНБ) и 19 здоровых доноров. Возраст здоровых доноров варьировал от 25 до 40 лет.

Возраст больных ХОБЛ варьировал от 28 до 55 лет, из них 37% составили  женщины, а 63% - мужчины. Средний возраст  всех пациентов составил 46,9±3,3 года.

Общим для всех пациентов  было прогрессирование бронхолегочного заболевания.

Оценка тяжести заболевания  ХОБЛ проводилась в соответствии с Рекомендациями Европейского респираторного общества – в зависимости от величины ОФВ₁.