Оксид азота и биоцидность фагоцитов крови и легких в патогенезе хронических обструктивных болезней легких

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 28 Февраля 2013 в 15:27, диссертация

Описание

Цель исследования: провести комплексное исследование взаимосвязи окислительного метаболизма нейтрофилов крови и фагоцитов легких с уровнем оксида азота для выявления особенностей течения хронических обструктивных болезней легких.
Задачи исследования:
1. Определить содержание оксида азота в сыворотке крови и в бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких.
2. Выявить взаимосвязь окислительного метаболизма нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости с оксидом азота при его ингибировании NG-монометил-L-аргинин у больных хроническими обструктивными болезнями легких in vitro.
2.1. Оценить окислительный метаболизм нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости при хронических обтруктивных болезнях легких по степени генерации активных метаболитов кислорода.
2.2. Оценить влияние ингибитора NG-монометил-L-аргинина на исходное состояние окислительного метаболизма нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости у больных хроническими обструктивными болезнями легких.
2.3. Оценить влияние ингибитора NG-монометил-L-аргинина на окислительный метаболизм при стимуляции зимозаном нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости.
3. Определить содержание цитокинов: интерлейкина-1, интерлейкина-4 и интерлейкина-6 в сыворотке крови и в бронхоальвеолярной лаважной жидкости при хронических обструктивных болезнях легких.

Содержание

ВВЕДЕНИЕ ………………………………….…………………….……5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ……………….……………………12
Патогенетические аспекты хронических обструктивных болезней легких………………………………………………12
1.1. Основные патогенетические звенья хронических обструктивных болезней легких …………….…15
1.1.1. Роль фагоцитов крови и легких в патогенезе хронических обструктивных болезней легких ……..19
1.1.2. Цитокины в патогенезе воспаления при хронических обструктивных болезней легких ……………….…23
1.1.3. Роль прооксидантной и антиоксидантной системы…………….29
1.1.4. Значение оксида азота…………………………………………….35
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ………………………………44
2.1. Материалы исследования………………………………………….44
2.2. Методы исследования………………………………………………46
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.......53
3.1. Клинико-биохимические показатели крови больных хроническими обструктивными болезнями легких………53
3.2. Потенциальная биоцидная функция нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких…………………………….57
3.2.1. Спонтанный хемилюминисцентный ответ……………………...58
3.2.2. Зимозан-индуцированный хемилюминисцентный ответ………60
3.3. Влияние ингибитора L-аргинина на потенциальную биоцидную функцию нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких…………………..62
3.3.1. Влияние ингибитора L-аргинина на продукцию активных метаболитов кислорода нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости …………………………………………..62
3.3.2. Влияние ингибитора L-аргинина на зимозан-индуцированную продукцию активных метаболитов кислорода нейтрофилами крови и фагоцитами бронхоальвеолярной лаважной жидкости …………….66
3.4. Содержание цитокинов: интерлейкина-1, интерлейкина-4 и интерлейкина-6 в сыворотке крови и бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких…………………………………………69
3.5. Содержание оксида азота (NO) в сыворотке крови и бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных хроническими обструктивными болезнями легких……………………………………72
3.6. Корреляционные связи между активностью окислительного метаболизма нейтрофилов крови и фагоцитов бронхоальвеолярной лаважной жидкости и содержанием оксида азота у больных хроническими обструктивными болезнями легких…………………………….80
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ…..86
ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………..98
ВЫВОДЫ……………………………………………………………….101
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………….103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………….104

Работа состоит из  1 файл

Дисс_Юрковой.doc

— 6.40 Мб (Скачать документ)

Важно, что по свойствам  клетки БАЛ жидкости близки тем же клеткам самого легкого. Иными словами, по клеткам БАЛ можно достаточно уверенно судить о том, что происходит в легочной ткани, а если это воспаление – то о его характере, активности и тенденциях. Исследование окислительно-метаболической функции фагоцитов БАЛ жидкости больных ХОБЛ показало, что у больных ХОБ отмечается ее минимальная активность, а максимальные значения с-ХЛ ответа были у больных ХНБ и БА в сочетании с ХОБ. У больных БА в сочетании с ХНБ с-ХЛ ответ фагоцитов БАЛ жидкости был ниже, чем у больных ХНБ и БА в сочетании с ХОБ, но выше, чем у больных ХОБ. В то же время была выявлена широкая вариабельность с-ХЛ ответа фагоцитов БАЛ жидкости у больных ХНБ. Иначе говоря, продукция АМК фагоцитами БАЛ жидкости возрастала у больных с более тяжелым течением ХНБ и ХОБЛ. Это связано с увеличением количества фагоцитов, вовлекаемых в патологический процесс. Рекрутирование примированных нейтрофилов интерстиция в дыхательные пути под действием биологически активных веществ способствует еще в большей степени увеличению выработки последними различных медиаторов, которые, попадая в кровь, «рекрутируют» все новые и новые фагоциты.

Выраженный спонтанный флогогенный потенциал фагоцитов  БАЛ жидкости больных ХНБ и БА в сочетании с ХОБ является характеристикой активности воспалительного процесса в слизистой бронхиального дерева.

Сравнительный анализ результатов  спонтанного ХЛ ответа нейтрофилов  крови и фагоцитов БАЛ жидкости больных ХНБ и ХОБЛ показал, что легочные фагоциты продуцировали АМК на порядок больше, чем нейтрофилы крови. Данный вывод подтверждает концепцию того, что легочные фагоциты определяют «барьер стратегического плана», т.е. детерминируют резистентность легких к повреждению. Учитывая вышеизложенное, становится вполне понятна высокая тенденция фагоцитов БАЛ жидкости к выработки АМК.

АМК сами способны вызывать бронхоконстрикцию, кроме того, гистамин в ходе развития хронических обструктивных  болезней легких способен вызывать продукцию АМК вследствие извращения реакции на него нейтрофилов – при бронхиальной астме растормаживается ингибирующее действие гистамина на нейтрофилы; сходным образом действует и ацетилхолин, кроме того, происходит снижение АМК ингибирующей функции тромбоцитов в отношении нейтрофилов (Коган, 1999). Увеличивается также генерация АМК в ходе приступа бронхиальной астмы, причем обнаруживается параллелизм в тяжести астматических приступов и генерации АМК нейтрофилами и повышением содержания в крови ПОЛ. На основании вышесказанного становится понятным усугубление бронхообструктивного синдрома в группах больных ХОБЛ.

Активные нейтрофилы вырабатывают значительно больше флогогенных  факторов, увеличние числа которых  способствует активации непримированных  нейтрофилов. Учитывая вышеизложенное, в нашем исследовании для прогнозирования степени повреждения слизистой бронхиального дерева при ХОБЛ, проводили оценку зимозан-индуцированной биоцидной активности нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости.

Так, минимальные значения выработки АМК нейтрофилами крови при их индукции зимозаном были выявлены у больных ХНБ, а максимальные – у больных БА в сочетании с ХОБ. Максимальный и-ХЛ ответ нейтрофилов на дополнительный стимул у больных БА в сочетании с ХОБ свидетельствует о высокой готовности клеток к реализации своего цитотоксического (деструктивного) потенциала. Такая же тенденция в изменениях и-ХЛ ответа отмечается у фагоцитов БАЛ жидкости больных ХОБЛ. Активный примированный нейтрофил обладает внезапностью и скоростью метаболической перестройки (по этому признаку нейтрофил лидирует среди фагоцитов и, по-видимому, всех остальных клеток). Такая способность нейтрофила делает его «опасным» по деструктивным способностям по отношению к клеткам организма. В данном исследовании было выявлено, что биоцидная активность примированого нейтрофила нарастает пропорционально тяжести заболевания, потенцируя тем самым усугубления воспалительного процесса.

Санирующая сила нейтрофилов  крови и фагоцитов БАЛ жидкости почти на 90% связана с их способностью генерировать АМК. Вместе с тем фагоциты могут убивать микробы и другими способами. Так, недавно было установлено, что фагоциты вырабатывают не только АМК, но и оксид азота, источником которого служит аминокислота аргинин, однако существует мнение, что NO при определенных обстоятельствах может выступать и как антиоксидант. Для понимания значимости оксида азота (NO) в «театре» окислительного стресса, в наших исследованиях ингибировали L-аргинин, а потом оценивали зимозан-индуцированную активность нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости при культивировании с NG-монометил-L-аргинином.

Нейтрофилы крови и  фагоциты БАЛ жидкости больных ХНБ  и ХОБЛ при блокаде аминокислоты аргинина ингибитором NGMA отвечали достоверным изменением продукции АМК, а именно увеличением генерации АМК в десятки раз (в группе больных ХНБ увеличение выработки АМК нейтрофилами крови произошло в 56 раз, в группе больных ХОБ – в 171 раз (!), в группе БА в сочетании с ХНБ – в 151 раз (!) и в группе БА в сочетании с ХОБ – в 81 раз). При этом было показано, что у больных ХОБЛ АМК генерирующая способность нейтрофилов крови была выше, чем у фагоцитов БАЛ жидкости.

НАДФН-оксидаза является мультикомпонентным мембраносвязанным  цитользольным комплексом. NO-синтаза также является мембранным цитозольным комплексом. И в образовании супероксиданион радикала и NO в качестве кофактора используется НАДФН, ФАД и, возможно, тетрагидробиоптерин (Зенков Н.К., Ланкин В.З., 2001). На основании вышеизложенного становится вполне понятным резкое увеличение выработки АМК фагоцитом при ингибировании L-аргинина. 

При культивировании  зимозан-индуцированных нейтрофилов  крови больных ХОБЛ с ингибитором L-аргинина, отмечался достоверный рост АМК генерирующей способности нейтрофилов, тогда как ХЛ ответ зимозан-индуцированных фагоцитов БАЛ жидкости, напротив, снижался. Однако, изменение показателей данного исследования у нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости, обследованных групп больных не было достоверным, кроме достоверного снижения зимозан-индуцированного ХЛ ответа фагоцитов БАЛ жидкости больных БА в сочетании с ХОБ (P<0,05).

Количество фагоцитов  и их активность в легких зависит  не только от их контакта с экологическими вредностями, но и от проницаемости  легочных капилляров. Любые агенты, активирующие эндотелий, будут создавать благоприятные условия для миграции легочных фагоцитов в интерстиций легких, и наоборот. К числу эндогенных активаторов эндотелия относятся цитокины фагоцитов (ИЛ-1) и лимфоцитов (ИЛ-4, ИЛ-6). Кроме того, вышеуказанные цитокины не только детерминируют воспаление, но и способны обеспечивать связь очага воспаления с целым организмом; цитокины запускают острофазовый ответ, который включает в себя усиленный синтез белков острой фазы, лихорадку, лейкоцитоз, отрицательный азотистый баланс и многое другое (Маянский Д.Н., 1991). 

Содержание цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-4 и ИЛ-6) в сыворотке крови  больных ХНБ и ХОБЛ в различной  степени выраженности превышали  контрольные значения. Наиболее значимое повышение в сыворотке крови обследованных больных было выявлено в содержании ИЛ-1. При анализе результатов определения ИЛ-4 в сыворотке крови было отмечено достоверное увеличение только у больных ХНБ и ХОБ. Что касается уровня содержания ИЛ-6 в сыворотке крови и в БАЛ жидкости обследованных групп больных, то его уровень достоверно был повышен у больных ХОБ и БА в сочетании с ХОБ. Увеличенное содержание   ИЛ-1, -4 в сыворотке крови больных ХНБ и ХОБ можно расценить как доминирование клеточных или гуморальных иммуных компанентов воспаления у данной категории пациентов. Повышенное содержание ИЛ-6 в БАЛ жидкости больных ХОБ и БА в сочетании с ХОБ может быть расценено как преобладание роли мононуклеаров и их медиаторов в развитии обструктивного синдрома при данных нозологических формах.

Для нормальной продукции  нейтрофилом АМК ему необходимо достаточное количество кислорода и НАДФН. Т.е. в целом, для образования достаточных порций О2-. и Н2О2, дающих начало другим, еще более мощным АМК необходимо, чтобы в клетке, во-первых, активно происходили процессы окисления и, во-вторых, чтобы клетка получала достаточное количество субстратов окисления (глюкозы и фосфолипидов). Активированные нейтрофилы, через продукцию АМК индуцируют свободно-радикальные реакции ПОЛ на мембранах эндотелия сосудов, и провоцируют их дальнейшее повреждение. По всей видимости, в ответ на повреждение сосудистой стенки в периваскулярное пространство инфильтрируются лейкоциты и, прежде всего – нейтрофилы, запускающие в ней асептическое воспаление. Лейкоциты инфильтрата активируются и подключаются к первичной ишемической деструкции клеток сосудистой стенки. Степень вторичной, лейкоцит-зависимой, деструкции сосудистой стенки будет прямо зависеть от биоцидности лейкоцитов, т.е., от их способности вырабатывать АМК (О2-, Н2О2, ОН- и пр.).

Нейтрофилы, находящиеся  в условии «метаболического взрыва», усиленно метаболизируют NO. Активные метаболиты кислорода, вырабатываемые в процессе оксидативного стресса, вступают в реакцию с NO, что приводит к образованию пероксинитрита – очень мощного окислителя. Известно, что активированные нейтрофилы подавляют секрецию NO путем прямого повреждающего действия АМК на эндотелий сосудов (Пустоветова М.Г., 2001). Не следует забывать о морфологических изменениях сосудистой стенки, которые наблюдается у больных ХОБЛ при тяжелом течении. Морфологически измененный эндотелиоцит не в состоянии нормально синтезировать вазадилятаторы. Как упоминалось выше, АМК выполняют санирующую роль, но однако могут нанести вред, как самим фагоцитам, так и другим клеткам организма. Естественно, что все эти клетки стараются избавиться от супероксид-радикалов, для чего они вырабатывают ферменты, называемые супероксиддисмутазами (СОД). Различаясь по строению активного центра и структуре полипептидной цепи, все СОД катализируют одну и ту же реакцию дисмутации супероксидного радикала:

О2- + О2- + 2Н+ → О2 + Н2О2

При этом супероксид превращается в кислород и перекись водорода. Ишемия, парадоксально, не отражается на продукции АМК, в то же время, выражено повреждает аэробные ткани вследствие недостатка обычного кислорода. Так, показано, что снижение кислорода в 100 раз по отношению к атмосферному, снижает продукцию АМК макрофагами не более чем на 25% (34ж). В то же время, активность СОД, глутатионпероксидазы в ишемизированной области снижается уже в первые минуты ишемии и сохраняется в течение всего периода (Лапкин и др., 1982).

 Оксид азота (NO) выделяется также клетками-фагоцитами  и вместе с супероксидными радикалами используется для борьбы с микробами. Полагают, что цитотоксическое действие NO обусловлено его реакцией с супероксидом. Пероксинитрит, образующийся в этой реакции, может разлагаться с образованием гидроксила.

Образование пероксинитрита и радикала гидроксила приводит к  повреждению клеток. Хорошо, если повреждающее действие системы направлено на болезнетворные микроорганизмы. Плохо, если оно направлено на свои собственные клетки и ткани. Поэтому в тех участках кровяного русла, где выделяется NO. (как необходимый регулятор кровяного давления), не должно быть супероксидных радикалов. Для этого, в частности, в этих местах синтезируется фермент СОД, который удаляет супероксид.

В условиях хронического воспаления в очаге повреждения ткани испытывается кислородное голодание, что ведет к снижению выработки оксида азота.

В условиях гипоксии оксид  азота оказывает защитный эффект, являясь источником окислов азота, которые могут выступать донорами электронов для цитохромоксидазы, определяющей молекулярную основу НАДФН-оксидазной активности фагоцитов (Bloch K.D., Wolfram J.R., 1995).

На основании вышеизложенного  в нашем исследовании определяли уровень содержания оксида азота в сыворотке крови больных ХНБ и ХОБЛ: в группах больных ХНБ и БА в сочетании с ХНБ была выявлена лишь тенденция к снижению уровня оксида азота, тогда как у больных ХОБ и БА в сочетании с ХОБ было отмечено достоверное снижение его уровня. Подобная картина имела место при определении содержания оксида азота в БАЛ жидкости больных ХОБ и БА в сочетании с ХОБ.

В механизмах развития и  детерминирования хронических обструктивных  болезней легких присутствует один из важных патофизиологических процессов, а именно дисбаланс в системе «оксиданты-антиоксиданты». Результаты исследовния данной работы свидетельствуют о том, что выработка АМК увеличивается пропорционально тяжести течения заболевания. Учитывая патологически измененный цитокиновый фон, формируемый активированными нейтрофилами, опосредованно через цепь каскадных реакций происходит примирование новых фагоцитов. В поврежденной ткани нарастает гипоксия. Данные, полученные в ходе работы, свидетельствуют о том, что оксид азота в условиях хронического воспаления ведет себя как антиоксидант – оказывает защитную функцию в условиях гипоксии; активированный же нейтрофил подавляет выработку оксида азота, создавая условия для погрессирования воспалительного процесса, в результате чего происходит формирование «порочного круга».

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние время  очень много говорится о балансе  в системе «оксиданты-антиоксиданты», поскольку в зависимости от того, насколько стабильно сохранение этого «призрачного» равновесия зависит развитие событий в очаге воспаления и, соответсвенно, исход заболевания. НАДФН-оксидаза и                   NO-синтаза в давольно-таки ограниченном клеточном пространстве являются «конкурентами» за использование НАДФН, который и в том, и в другом случае является кофактором. Как было сказано выше, НАДФН-оксидаза представляет собой мультикомпонентную систему, состоящую из мембрансвязанных и цитозольных компонентов. Мембрансвязанный низко потенциальный цитохром b-245 (b558) состоит из 2 субъединиц α и β. В нестимулированных нейтрофилах 85% цитохром b558 локализовано на мембранах специфических и желатиназных гранул и около 5% - на цитоплазматической мембране, остальные 10% связаны с секреторными везикулами. Для генерации О-2 также необходимы два цитозольных компонента, которые в покоящейся клетке находятся в виде комплекса с третьим цитоплазматическим компонентом. При стимулировании фагоцитов происходит быстрая (индукция хемотаксическими пептидами происходит в течение 2 сек) самосборка из мембранных и цитозольных компонентов НАДФН-оксидазного комплекса, осуществляющего перенос электрона с цитозольного НАДФН на О2 с образованием О-2. Генерация О-2 и Н2О2 происходит через несколько минут после стимуляци клеток, оксид азота синтезируется через часы. В условиях хронического воспаления доминирующую позицию занимают примированные нейтрофилы и тканевая гипоксия. При таких условиях снижается уровень ферментов «блокирующих» переизбыток АМК – СОД. На основании вышесказаноого можно сделать предположение, что при таких условиях воспаление примет хроническое рецидивирующее течение.

Информация о работе Оксид азота и биоцидность фагоцитов крови и легких в патогенезе хронических обструктивных болезней легких