Оксид азота и биоцидность фагоцитов крови и легких в патогенезе хронических обструктивных болезней легких

Важно, что по свойствам  клетки БАЛ жидкости близки тем же клеткам самого легкого. Иными словами, по клеткам БАЛ можно достаточно уверенно судить о том, что происходит в легочной ткани, а если это воспаление – то о его характере, активности и тенденциях. Исследование окислительно-метаболической функции фагоцитов БАЛ жидкости больных ХОБЛ показало, что у больных ХОБ отмечается ее минимальная активность, а максимальные значения с-ХЛ ответа были у больных ХНБ и БА в сочетании с ХОБ. У больных БА в сочетании с ХНБ с-ХЛ ответ фагоцитов БАЛ жидкости был ниже, чем у больных ХНБ и БА в сочетании с ХОБ, но выше, чем у больных ХОБ. В то же время была выявлена широкая вариабельность с-ХЛ ответа фагоцитов БАЛ жидкости у больных ХНБ. Иначе говоря, продукция АМК фагоцитами БАЛ жидкости возрастала у больных с более тяжелым течением ХНБ и ХОБЛ. Это связано с увеличением количества фагоцитов, вовлекаемых в патологический процесс. Рекрутирование примированных нейтрофилов интерстиция в дыхательные пути под действием биологически активных веществ способствует еще в большей степени увеличению выработки последними различных медиаторов, которые, попадая в кровь, «рекрутируют» все новые и новые фагоциты.

Выраженный спонтанный флогогенный потенциал фагоцитов  БАЛ жидкости больных ХНБ и БА в сочетании с ХОБ является характеристикой активности воспалительного процесса в слизистой бронхиального дерева.

Сравнительный анализ результатов  спонтанного ХЛ ответа нейтрофилов  крови и фагоцитов БАЛ жидкости больных ХНБ и ХОБЛ показал, что легочные фагоциты продуцировали АМК на порядок больше, чем нейтрофилы крови. Данный вывод подтверждает концепцию того, что легочные фагоциты определяют «барьер стратегического плана», т.е. детерминируют резистентность легких к повреждению. Учитывая вышеизложенное, становится вполне понятна высокая тенденция фагоцитов БАЛ жидкости к выработки АМК.

АМК сами способны вызывать бронхоконстрикцию, кроме того, гистамин в ходе развития хронических обструктивных  болезней легких способен вызывать продукцию АМК вследствие извращения реакции на него нейтрофилов – при бронхиальной астме растормаживается ингибирующее действие гистамина на нейтрофилы; сходным образом действует и ацетилхолин, кроме того, происходит снижение АМК ингибирующей функции тромбоцитов в отношении нейтрофилов (Коган, 1999). Увеличивается также генерация АМК в ходе приступа бронхиальной астмы, причем обнаруживается параллелизм в тяжести астматических приступов и генерации АМК нейтрофилами и повышением содержания в крови ПОЛ. На основании вышесказанного становится понятным усугубление бронхообструктивного синдрома в группах больных ХОБЛ.

Активные нейтрофилы вырабатывают значительно больше флогогенных  факторов, увеличние числа которых  способствует активации непримированных  нейтрофилов. Учитывая вышеизложенное, в нашем исследовании для прогнозирования степени повреждения слизистой бронхиального дерева при ХОБЛ, проводили оценку зимозан-индуцированной биоцидной активности нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости.

Так, минимальные значения выработки АМК нейтрофилами крови при их индукции зимозаном были выявлены у больных ХНБ, а максимальные – у больных БА в сочетании с ХОБ. Максимальный и-ХЛ ответ нейтрофилов на дополнительный стимул у больных БА в сочетании с ХОБ свидетельствует о высокой готовности клеток к реализации своего цитотоксического (деструктивного) потенциала. Такая же тенденция в изменениях и-ХЛ ответа отмечается у фагоцитов БАЛ жидкости больных ХОБЛ. Активный примированный нейтрофил обладает внезапностью и скоростью метаболической перестройки (по этому признаку нейтрофил лидирует среди фагоцитов и, по-видимому, всех остальных клеток). Такая способность нейтрофила делает его «опасным» по деструктивным способностям по отношению к клеткам организма. В данном исследовании было выявлено, что биоцидная активность примированого нейтрофила нарастает пропорционально тяжести заболевания, потенцируя тем самым усугубления воспалительного процесса.

Санирующая сила нейтрофилов  крови и фагоцитов БАЛ жидкости почти на 90% связана с их способностью генерировать АМК. Вместе с тем фагоциты могут убивать микробы и другими способами. Так, недавно было установлено, что фагоциты вырабатывают не только АМК, но и оксид азота, источником которого служит аминокислота аргинин, однако существует мнение, что NO при определенных обстоятельствах может выступать и как антиоксидант. Для понимания значимости оксида азота (NO) в «театре» окислительного стресса, в наших исследованиях ингибировали L-аргинин, а потом оценивали зимозан-индуцированную активность нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости при культивировании с NG-монометил-L-аргинином.

Нейтрофилы крови и  фагоциты БАЛ жидкости больных ХНБ  и ХОБЛ при блокаде аминокислоты аргинина ингибитором NGMA отвечали достоверным изменением продукции АМК, а именно увеличением генерации АМК в десятки раз (в группе больных ХНБ увеличение выработки АМК нейтрофилами крови произошло в 56 раз, в группе больных ХОБ – в 171 раз (!), в группе БА в сочетании с ХНБ – в 151 раз (!) и в группе БА в сочетании с ХОБ – в 81 раз). При этом было показано, что у больных ХОБЛ АМК генерирующая способность нейтрофилов крови была выше, чем у фагоцитов БАЛ жидкости.

НАДФН-оксидаза является мультикомпонентным мембраносвязанным  цитользольным комплексом. NO-синтаза также является мембранным цитозольным комплексом. И в образовании супероксиданион радикала и NO в качестве кофактора используется НАДФН, ФАД и, возможно, тетрагидробиоптерин (Зенков Н.К., Ланкин В.З., 2001). На основании вышеизложенного становится вполне понятным резкое увеличение выработки АМК фагоцитом при ингибировании L-аргинина. 

При культивировании  зимозан-индуцированных нейтрофилов  крови больных ХОБЛ с ингибитором L-аргинина, отмечался достоверный рост АМК генерирующей способности нейтрофилов, тогда как ХЛ ответ зимозан-индуцированных фагоцитов БАЛ жидкости, напротив, снижался. Однако, изменение показателей данного исследования у нейтрофилов крови и фагоцитов БАЛ жидкости, обследованных групп больных не было достоверным, кроме достоверного снижения зимозан-индуцированного ХЛ ответа фагоцитов БАЛ жидкости больных БА в сочетании с ХОБ (P<0,05).

Количество фагоцитов  и их активность в легких зависит  не только от их контакта с экологическими вредностями, но и от проницаемости  легочных капилляров. Любые агенты, активирующие эндотелий, будут создавать благоприятные условия для миграции легочных фагоцитов в интерстиций легких, и наоборот. К числу эндогенных активаторов эндотелия относятся цитокины фагоцитов (ИЛ-1) и лимфоцитов (ИЛ-4, ИЛ-6). Кроме того, вышеуказанные цитокины не только детерминируют воспаление, но и способны обеспечивать связь очага воспаления с целым организмом; цитокины запускают острофазовый ответ, который включает в себя усиленный синтез белков острой фазы, лихорадку, лейкоцитоз, отрицательный азотистый баланс и многое другое (Маянский Д.Н., 1991). 

Содержание цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-4 и ИЛ-6) в сыворотке крови  больных ХНБ и ХОБЛ в различной  степени выраженности превышали  контрольные значения. Наиболее значимое повышение в сыворотке крови обследованных больных было выявлено в содержании ИЛ-1. При анализе результатов определения ИЛ-4 в сыворотке крови было отмечено достоверное увеличение только у больных ХНБ и ХОБ. Что касается уровня содержания ИЛ-6 в сыворотке крови и в БАЛ жидкости обследованных групп больных, то его уровень достоверно был повышен у больных ХОБ и БА в сочетании с ХОБ. Увеличенное содержание   ИЛ-1, -4 в сыворотке крови больных ХНБ и ХОБ можно расценить как доминирование клеточных или гуморальных иммуных компанентов воспаления у данной категории пациентов. Повышенное содержание ИЛ-6 в БАЛ жидкости больных ХОБ и БА в сочетании с ХОБ может быть расценено как преобладание роли мононуклеаров и их медиаторов в развитии обструктивного синдрома при данных нозологических формах.

Для нормальной продукции  нейтрофилом АМК ему необходимо достаточное количество кислорода и НАДФН. Т.е. в целом, для образования достаточных порций О^2-. и Н₂О₂, дающих начало другим, еще более мощным АМК необходимо, чтобы в клетке, во-первых, активно происходили процессы окисления и, во-вторых, чтобы клетка получала достаточное количество субстратов окисления (глюкозы и фосфолипидов). Активированные нейтрофилы, через продукцию АМК индуцируют свободно-радикальные реакции ПОЛ на мембранах эндотелия сосудов, и провоцируют их дальнейшее повреждение. По всей видимости, в ответ на повреждение сосудистой стенки в периваскулярное пространство инфильтрируются лейкоциты и, прежде всего – нейтрофилы, запускающие в ней асептическое воспаление. Лейкоциты инфильтрата активируются и подключаются к первичной ишемической деструкции клеток сосудистой стенки. Степень вторичной, лейкоцит-зависимой, деструкции сосудистой стенки будет прямо зависеть от биоцидности лейкоцитов, т.е., от их способности вырабатывать АМК (О^2-, Н₂О₂, ОН^- и пр.).

Нейтрофилы, находящиеся  в условии «метаболического взрыва», усиленно метаболизируют NO. Активные метаболиты кислорода, вырабатываемые в процессе оксидативного стресса, вступают в реакцию с NO, что приводит к образованию пероксинитрита – очень мощного окислителя. Известно, что активированные нейтрофилы подавляют секрецию NO путем прямого повреждающего действия АМК на эндотелий сосудов (Пустоветова М.Г., 2001). Не следует забывать о морфологических изменениях сосудистой стенки, которые наблюдается у больных ХОБЛ при тяжелом течении. Морфологически измененный эндотелиоцит не в состоянии нормально синтезировать вазадилятаторы. Как упоминалось выше, АМК выполняют санирующую роль, но однако могут нанести вред, как самим фагоцитам, так и другим клеткам организма. Естественно, что все эти клетки стараются избавиться от супероксид-радикалов, для чего они вырабатывают ферменты, называемые супероксиддисмутазами (СОД). Различаясь по строению активного центра и структуре полипептидной цепи, все СОД катализируют одну и ту же реакцию дисмутации супероксидного радикала:

О₂^- + О₂^- + 2Н⁺ → О2 + Н₂О₂

При этом супероксид превращается в кислород и перекись водорода. Ишемия, парадоксально, не отражается на продукции АМК, в то же время, выражено повреждает аэробные ткани вследствие недостатка обычного кислорода. Так, показано, что снижение кислорода в 100 раз по отношению к атмосферному, снижает продукцию АМК макрофагами не более чем на 25% (34ж). В то же время, активность СОД, глутатионпероксидазы в ишемизированной области снижается уже в первые минуты ишемии и сохраняется в течение всего периода (Лапкин и др., 1982).

 Оксид азота (NO) выделяется также клетками-фагоцитами  и вместе с супероксидными радикалами используется для борьбы с микробами. Полагают, что цитотоксическое действие NO обусловлено его реакцией с супероксидом. Пероксинитрит, образующийся в этой реакции, может разлагаться с образованием гидроксила.

Образование пероксинитрита и радикала гидроксила приводит к  повреждению клеток. Хорошо, если повреждающее действие системы направлено на болезнетворные микроорганизмы. Плохо, если оно направлено на свои собственные клетки и ткани. Поэтому в тех участках кровяного русла, где выделяется NO^. (как необходимый регулятор кровяного давления), не должно быть супероксидных радикалов. Для этого, в частности, в этих местах синтезируется фермент СОД, который удаляет супероксид.

В условиях хронического воспаления в очаге повреждения ткани испытывается кислородное голодание, что ведет к снижению выработки оксида азота.

В условиях гипоксии оксид  азота оказывает защитный эффект, являясь источником окислов азота, которые могут выступать донорами электронов для цитохромоксидазы, определяющей молекулярную основу НАДФН-оксидазной активности фагоцитов (Bloch K.D., Wolfram J.R., 1995).

На основании вышеизложенного  в нашем исследовании определяли уровень содержания оксида азота в сыворотке крови больных ХНБ и ХОБЛ: в группах больных ХНБ и БА в сочетании с ХНБ была выявлена лишь тенденция к снижению уровня оксида азота, тогда как у больных ХОБ и БА в сочетании с ХОБ было отмечено достоверное снижение его уровня. Подобная картина имела место при определении содержания оксида азота в БАЛ жидкости больных ХОБ и БА в сочетании с ХОБ.

В механизмах развития и  детерминирования хронических обструктивных  болезней легких присутствует один из важных патофизиологических процессов, а именно дисбаланс в системе «оксиданты-антиоксиданты». Результаты исследовния данной работы свидетельствуют о том, что выработка АМК увеличивается пропорционально тяжести течения заболевания. Учитывая патологически измененный цитокиновый фон, формируемый активированными нейтрофилами, опосредованно через цепь каскадных реакций происходит примирование новых фагоцитов. В поврежденной ткани нарастает гипоксия. Данные, полученные в ходе работы, свидетельствуют о том, что оксид азота в условиях хронического воспаления ведет себя как антиоксидант – оказывает защитную функцию в условиях гипоксии; активированный же нейтрофил подавляет выработку оксида азота, создавая условия для погрессирования воспалительного процесса, в результате чего происходит формирование «порочного круга».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние время  очень много говорится о балансе  в системе «оксиданты-антиоксиданты», поскольку в зависимости от того, насколько стабильно сохранение этого «призрачного» равновесия зависит развитие событий в очаге воспаления и, соответсвенно, исход заболевания. НАДФН-оксидаза и                   NO-синтаза в давольно-таки ограниченном клеточном пространстве являются «конкурентами» за использование НАДФН, который и в том, и в другом случае является кофактором. Как было сказано выше, НАДФН-оксидаза представляет собой мультикомпонентную систему, состоящую из мембрансвязанных и цитозольных компонентов. Мембрансвязанный низко потенциальный цитохром b_-245 (b₅₅₈) состоит из 2 субъединиц α и β. В нестимулированных нейтрофилах 85% цитохром b₅₅₈ локализовано на мембранах специфических и желатиназных гранул и около 5% - на цитоплазматической мембране, остальные 10% связаны с секреторными везикулами. Для генерации О^-₂ также необходимы два цитозольных компонента, которые в покоящейся клетке находятся в виде комплекса с третьим цитоплазматическим компонентом. При стимулировании фагоцитов происходит быстрая (индукция хемотаксическими пептидами происходит в течение 2 сек) самосборка из мембранных и цитозольных компонентов НАДФН-оксидазного комплекса, осуществляющего перенос электрона с цитозольного НАДФН на О₂ с образованием О^-₂. Генерация О^-₂ и Н₂О₂ происходит через несколько минут после стимуляци клеток, оксид азота синтезируется через часы. В условиях хронического воспаления доминирующую позицию занимают примированные нейтрофилы и тканевая гипоксия. При таких условиях снижается уровень ферментов «блокирующих» переизбыток АМК – СОД. На основании вышесказаноого можно сделать предположение, что при таких условиях воспаление примет хроническое рецидивирующее течение.