Автор работы: Пользователь скрыл имя, 01 Марта 2013 в 14:24, диссертация
Цель исследования. Целью работы являлось создание биосенсоров электрохимического типа для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas, являющихся деструкторами п-толуолсульфоната и фенола, соответственно.
Список используемых сокращений 6
1. ВВЕДЕНИЕ 7
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Биосенсоры как направление
в аналитической биотехнологии 13
2.1. Типы преобразователей, используемые в
биосенсорах. Электрохимические преобразователи 14
2.2. Типы биологических материалов, применяемых в
рецепторных элементах биосенсоров 15
2.2.1. Сенсоры на основе ферментов, антител и
иммунных комплексов, ДНК, животных и
растительных клеток, клеточных органоидов 15
2.2.2. Сенсоры на основе микробных клеток 17
2.2.2.1. Микробные сенсоры в мониторинге газовых
и водных сред 19
2.2.2.1.1. Мониторинг атмосферы 19
2.2.2.1.2. Мониторинг гидросферы 20
2.2.2.2. Классы соединений, детектируемых с помощью
микробных биосенсоров 21
2.2.2.2.1. Определение БПК 21
2.2.2.2.2. Детекция мутагенов и поллютантов 25
2.2.2.2.3. Сенсоры для определения анионных
поверхностно-активных веществ (ПАВ) 28
2.2.2.3. Методы иммобилизации биологического
материала в рецепторном элементе сенсора 29
2.3. Микроорганизмы-деструкторы и их использование
в разработке биосенсоров для детекции токсичных
соединений 30
2.3.1. Микроорганизмы-деструкторы токсичных соединений 30
2.3.2. Методы направленной модификации
микроорганизмов для придания им деструктивных свойств 34
2.3.3. Плазмидная детерминированность генов биодеградации 35
2.4. Потребности в детекции ароматических и
сульфоароматических соединений 36
2.4.1. Ароматические соединений и их влияние на экосистемы 36
2.4.2. Краткая характеристика сульфоароматических
соединений 36
2.4.3. Возможный механизм биодеградации
толуолсульфоната (ТС) 37
2.5. Характеристика штамма Comamonas testosteroni 38
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
3.1. Изучение Исследование способности микроорганизмов
к деградации толуолсульфоната (ТС) 41
3.1.1. Трансформация ТС свободными клетками 41
3.1.2. Деградация ТС иммобилизованными клетками 42
3.1.3. Определение скорости ферментативной реакции клеток 42
3.1.4. Деградация ТС в непрерывных условиях 42
3.1.5. Контроль процесса деградации 43
3.1.6. Получение плазмидного и бесплазмидного варианта
штамма C. testosteroni 43
3.2. Разработка микробного сенсора для определения
п-толуолсульфоната 44
3.2.1. Среда культивирования 44
3.2.2. Иммобилизация микроорганизмов 44
3.2.3. Исследование деградирующей активности
микроорганизмов 44
3.3. Разработка микробного сенсора для детекции фенола 45
3.3.1. Объект исследования 45
3.3.2. Штаммы-деструкторы фенола 46
3.3.3. Иммобилизация клеток 46
3.3.4. Хранение беактериальных штаммов 47
3.3.5. Скорость окисления субстрата
бактериальными клетками 47
3.4. Характеристика полярографической измерительной
системы 48
3.5. Деградация фенола в колоночном реакторе с
иммобилизованным активным илом установки
биохимочистки (БХО) 49
3.5.1. Отбор проб активного ила 49
3.5.2. Иммобилизация активного ила 49
3.5.3. Условия эксперимента 49
3.5.4. Контроль на входе и выходе колонки 49
3.5.5. Данные по работе установки биохимочистки 49
3.5.6. Определение фенола 50
3.6. Оптимизация работы установки БХО 50
3.6.1. Концентрация растворенного кислорода 50
3.6.2. Проведение замеров 50
3.7. Статистическая обработка полученных результатов 50
3.8. Основные технические параметры анализатора 50
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 51
4.1. Биодеградация ТС с помощью
C.testosteroni BS1310(pBS1010) 52
4.1.1. Деградация ТС свободными и иммобилизованными
клетками в периодических условиях 52
4.1.2. Деградация ТС в непрерывных условиях 54
4.2. Сенсор для детекции п-толуолсульфоната (ТС) 57
4.2.1. Скрининг штаммов-деструкторов арилсульфонатов 57
4.2.2. Характеристика штамма Comamonas testosteroni 57
4.2.3. Характеристика сенсоров на основе
плазмидсодержащего и бесплазмидного штамма C. testosteroni 58
4.2.4. Исследование работы сенсора на основе клеток
Comamonas testosteroni в проточной системе 76
4.3. Разработка микробного биосенсора для детекции
фенола 80
4.3.1.Скрининг штаммов-деструкторов фенола 80
4.3.2. Характеристика штамма 32-I
(Субстратная специфичность) 84
4.3.3. Характеристика сенсоров на основе
плазмидсодержащего и бесплазмидного вариантов
штамма 32-I 85
4.4. Возможные пути решения практических задач
с применением биосенсорного подхода 97
4.4.1. Деградация целевых соединений сточных вод
иммобилизованными на колонке микроорганизмами
установки биохимочистки сточных вод (БХО) 100
4.4.2. Использование полученных данных для оценки
эффективности процесса очистки стоков в аэротенках
установки биохимической очистки 106
4.4.2.1. Исходное состояние установки биохимочистки 106
4.4.2.2. Результаты проведенных технических и
технологических мероприятий на сооружениях БХО 111
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 116
6. ВЫВОДЫ 118
7. ЛИТЕРАТУРА 120
Описан сенсор на основе Rhodococcus sp.Р1, обладающий высокой избирательностью по отношению к фенолу и хлорфенолам, которая была достигнута инкубированием его с соответствующим субстратом [121]. Rhodococcus также был использован в сенсоре для определения фенолов и хлорфенолов с линейной зависимостью между уровнем кривой и концентрацией фенола, 2 -, 3 -, и 4 - хлорфенола до 20×10-3 М. В работе использовался кислородный электрод с платиновым катодом [140]. Предел детекции для всех исследованных субстратов составлял 4×10-6 М. Сенсор оставался стабильным 21 день. Недостатком сенсора является довольно низкая селективность [140]. Сенсор, содержащий в составе рецептора клетки P.putida 87, может быть использован для быстрого измерения концентрации монохлорароматических соединений. Этот сенсор был более чувствителен к бензоату и 3-хлорбензоату, чем к 2 - и 4 - хлор, 2, 4- дихлорбензоату и 2, 4 - дихлорфенолу. Интересен относительно высокий сигнал на 3 - хлорфенол и отсутствие сигнала при вводе фенола. Нижние пределы детекции для этих веществ составляют 1×10-8 – 1×10-4 М [121]. Для определения монохлор - и дихлорфенолов разработан биосенсор, содержащий штамм T.cutaneum. Характерными особенностями сенсора являлись отсутствие реакции на бензоат и высокая избирательность к 4 - хлор, 3 - хлор, 2, 4 - и 2, 5 - дихлорфенолам. Сигналы на моно - и дихлорированные фенолы были выше, чем на нехлорированный фенол. Нижний предел детекции для всех изученных субстратов составлял 0.2×10-3 М [121].
Сенсор для определения фенола на основе клеток Pseudomonas putida позволял измерение с нижним пределом детекции 2×10-9 М, что сопоставимо с чувствительностью ферментных сенсоров. При этом линейная зависимость наблюдалась в диапазоне концентраций 1 - 10×10-9 М. Время ответа сенсора с момента введения субстрата составляло 1 мин. При хранении сенсор сохранял активность более месяца [141]. Предложен [142] амперометрический биосенсор для определения концентрации фенола, бензойной кислоты и их монохлорированных производных на основе штамма Pseudomonas putida DSM648. Предел детекции составил 0.1×10-6 М, линейный диапазон детекции составил до 6×10-5 М. При хранении сенсор был стабилен более 21 суток.
Разработаны сенсоры на основе P. fluorescenc и Sphingomonas sp. и кислородного электрода Кларка для селективной детекции нафталина. Для обоих сенсоров нижний предел детекции составил 7,8×10-8 М, что ниже ПДК в подземных водах в Нидерландах (5,4×10-7 М). Линейный диапазон детекции составил 7,8×10-8 – 2,3×10-5 М, время ответа сенсоров составило 2 мин, скорость анализа достигала 6 образцов в час. Рабочее время жизни сенсоров составило 20 дней. [143].
Сенсор для определения бензола в водных средах на основе кислородного электрода и бактерии Pseudomonas putida ML - 2 позволял производить измерения с линейным диапазоном детекции до 1.35×10-3 М, верхним пределом 3.55×10-3 М и временем одного измерения 2 - 10 мин. [144].
Сконструировано [145] два сенсора для определения салицилата на основе Pseudomonas cepacia, иммобилизованных в кальций-альгинатный гель. В первом сенсоре в качестве преобразователя был использован кислородный электрод, во втором - проточный калориметр. Чувствительность системы на основе проточного калориметра была в 100 раз выше, чем системы на основе кислородного электрода (5×10-6 М и 0.2×10-3 М соответственно). Сенсор показал высокую чувствительность к салицилату и бензойной кислоте. При высоких концентрациях фенола и салицилата наблюдалось субстратное ингибирование. Линейная зависимость ответов сенсора на концентрации салицилата в модели с кислородным электродом наблюдалась до концентрации 3×10-3 М [145].
Разработан [146] оптический биосенсор на основе генетически созданной биолюминесцентной катаболической бактерии P. fluorescens HK44, несущей гены катаболизма нафталина и салицилата. Сенсор работал в протоке при скоростях 2.5 - 5 мл/ мин, время определения составило: для 12×10-3 М нафталина 8 - 15 мин, для 0.12×10-3 М нафталина 24 мин, для 3,×10-5М салицилата 8 - 15 мин.
2.2.2.2.3.Сенсоры
для определения анионных повер
В состав бытовых
сточных вод входят анионные ПАВ,
в частности алкилбензолсульфон
Описан амперометрический биосенсор реакторного типа для мониторинга концентрации анионных ПАВ на основе LAS - деградирующих бактерий. Указанный датчик был успешно испытан на образцах речной воды. Падение сигнала было линейно пропорционально концентрации LAS до 6 мг/ л. Время одиночного анализа составляло 30 мин [20].
Биосенсор для детекции п-толуолсульфоната на основе бактерии C. testosteroni BS1310 (pBS1010) [147] позволяет измерение целевого вещества с нижним пределом детекции 5 мкМ.
2.2.2.3.
Методы иммобилизации
Для достижения оптимального режима функционирования биосенсора необходимо взаимодействие между катализатором и преобразующим элементом. Для этих целей применяется метод иммобилизации биомассы в рецепторном элементе [121, 127, 148-151], благодаря которому достигается:
- увеличение стабильности биосенсора,
- многоразовое использование биорецептора,
- использование меньшего количества биомассы по сравнению с вариантом, когда суспензия клеток вводится в измерительный раствор перед измерением (т.н. биотопливный элемент),
- возможность хранения рецепторного элемента, что создает предпосылки для промышленного производства анализатора.
Метод иммобилизации возник при разработке биотехнологий непрерывного длительного действия, требующих максимального концентрирования биокатализатора в единице объема, максимальной защищенности от внешних факторов и максимальной энергоемкости [148].
Иммобилизация не должна оказывать неблагоприятного влияния на используемые организмы и быть оптимальной с точки зрения стабильности биорецептора, особенно в случае экологического мониторинга in situ. Применяются физические (адсорбция, включение в гели) и химические (ковалентное связывание с носителями) методы иммобилизации. Однако было показано, что при использовании химических методов происходит снижение активности иммобилизованных клеток [11]. Наиболее простым и широко используемым физическим методом является центрифугирование или фильтрование микробной суспензии через фильтровальную бумагу, ацетилцеллюлозную или нейлоновую мембрану.
Широко применяется иммобилизация микроорганизмов путем включения в гелевые мембраны, такие как агар, желатина, коллаген, полиакриламид, поливиниловый спирт [121]. Включение микробных клеток в большинстве случаев обеспечивает более высокую рабочую стабильность и период хранения по сравнению с клетками, адсорбированными на фильтрах. Преимуществом такого метода является проницаемость гелей для субстрата и кислорода и невозможность вымывания микроорганизмов. В частности, показано позитивное влияние иммобилизации в агаровый гель на интенсивность и полноту биодеградации ароматических соединений [148]. В то же время гелевые мембраны замедляют ответ сенсора. Применяются также полимерные носители [127]. В газовых сенсорах используются также пленки МоО3 [149], титанилфталоцианиновые пленки [150]. Показано, что низкомолекулярные ненасыщенные модификаторы клеток в определенных условиях полностью инактивируют внутриклеточную активность микроорганизмов, в то время как полимерные реакционноспособные носители взаимодействуют с клетками, не затрагивая их внутриклеточных элементов [151].
2.3. Микроорганизмы-деструкторы
и их использование в разработк
Как было отмечено выше, значительное количество микробных биосенсоров разрабатывалось для нужд экологического мониторинга, в частности, детекции токсичных соединений. Амперометрический метод представляет собой определение количества кислорода, потребленного микроорганизмом для деструкции вещества. Поэтому целесообразно производить поиск микроорганизмов, пригодных в качестве основы рецепторного элемента сенсоров такого типа, среди микроорганизмов-деструкторов соответствующих токсичных соединений.
2.3.1. Микроорганизмы-деструкторы токсичных соединений
Микроорганизмы, обладающие способностью разрушать токсичны соединения, широко представлены в природных экосистемах. Так, из осадочных отложений Нью-Йоркской гавани выделено несколько видов бактерий, разлагающих диизопропиламиноэтиловый эфир метилфосфорной кислоты [4], а из вод Черного моря - бактерий, способных к деструкции фенола и резорцина [152]. Почвенная бактерия Rhodococcus erythropolis способна к деградации 2, 4 - динитрофенола [153, 154], 2 - хлор, 4, 6 - динитрофенола [154], пикриновой кислоты [155]. Почвенный штамм Corynebacterium species ПНК-2 осуществляет деструкцию повышенных (до 750 мг/ л) концентраций 2, 4-динитрофенола, а также фенола, бензойной кислоты и ее производных [156]. Возбудитель белой гнили базидиомицет Phanerochaete chrysosporium способен к биодеградации изомеров толуола, этилбензола и ксилола [157]. Из морской воды выделен штамм Comamonas testosteroni, деградирующий поли-3-гидроксибутират в качестве единственного источника углерода для роста [158].
29 бактериальных штаммов
- деструкторов
Phanerochaete chrysosporium был способен к деградации всех сульфонированных азопроизводных [161]. В работе [162] описан совместный рост Hydrogenophaga palleroni и Agrobacterium radiobacter на 4-аминобензолсульфонате. Hydrogenophaga palleroni дезаминирует 4-ABS, продуктами разложения которого питается Agrobacterium radiobacter [162]. Из ила рек были выделены штаммы Pseudomonas, способные деградировать аминобензолсульфонаты с выделением сульфита по мета-пути с помощью катехол-2,3-диоксигеназы. При этом наиболее активно деградировались п-толуолсульфонат и бензолсульфонат [163]. Cladosporium resinae (CMI88968) деградировал 1-фенилдодекан-п-сульфонат и 1-фенилундекан-п-сульфонат [164]. Бактерии из рода Pseudomonas были способны утилизировать нафталин, антрацен, стирол, этилбензол, 1-фенилэтанол, 2-фенилэтанол, ацетофенон, фенилуксусную кислоту, бензол [165], хлорбензол, толуол, о-ксилол, нафталин, бензиловый спирт [166], фенол [167]. Водоросль Ochromonas danica (993/ 28) метаболизировала фенол, все изомеры крезола и 3, 4 - ксилола из инкубационной среды [168]. P.putida [163 (169)] разлагал смесь толуола и п-ксилола. Из загрязненных фенолом почв и активного ила выделены штаммы Pseudomonas sp.и Bacillus sp., способные к деструкции фенола в концентрации 250 – 500 мг/ л [170]. Показано [171], что микроорганизмы ризосферы более активно разлагают фенол, чем почвенные микроорганизмы.
Есть данные об утилизации
некоторых арилсульфонатов
Бактерии родов Pseudomonas [181-183] и Comamonas способы к деградации арилсульфонатов, причем бактерии рода Comamonas представлены шире и отличаются большим разнообразием деградативных активностей. Показана способность штамма C.testosteroni разлагать п-толуолсульфонат (в проточной системе в реакторе на биопленках с перемешиванием среды максимальная скорость распада вещества составила 198 мг/С л ч [184]). 23 штамма C.testosteroni были способны к деструкции бензолсульфоната, п-толуолсульфоната, 2-нафталинсульфоната, п-сульфобензоата, 5-сульфосалицилата [185, 186]. Выделены ферменты пути расщепления сульфоароматических соединений [186-188]. Исследованы также гены, кодирующие эти ферменты [189, 190]. Штаммы - деструкторы 3-аминобензолсульфоната и 4-аминобензолсульфоната идентифицированы как C.acidovorans [134]. Выделен штамм C.acidovorans 191, использующий п-толуолсульфонат в качестве источника серы, но не в качестве источника углерода и энергии [191].
Бактериальные штаммы - деструкторы ароматических сульфонатов присутствовали в различных образцах активного ила из очистных сооружений химических предприятий и городов, географически удаленных друг от друга. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что способность к деструкции сульфоароматических соединений преимущественно распространена среди членов микробных популяций активного ила аэрируемых очистных сооружений, что можно объяснить присутствием данного класса органических соединений в сточных водах. Среди изолированных и идентифицированных бактериальных штаммов, способных использовать арилсульфонаты в качестве единственного источника углерода, серы и энергии, бактерии вида C.testosteroni составили подавляющее большинство (почти 80%). Штаммы - деструкторы, принадлежащие к этому виду, присутствовали во всех образцах активного ила [159].
Ароматические углеводороды, галогенированные и сульфонированные ароматические и алифатические соединения широко используются в производстве ПАВов, красителей, химической, упаковочной и древесной промышленности [191]. Показана целесообразность использования вышеуказанной технологии с использованием биомембран в сочетании с отбором специфически приспособленных микробных сообществ, для разрушения ксенобиотиков. Рассматривается способность к биодеградации п-толуолсульфоновой кислоты двумя бактериальными штаммами в суспензии и в иммобилизованных культурах [192].