Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comanonas и Pseudomonas - деструкторов n-толуолсульфона

Разработаны микробные  сенсоры для мультикомпонентного  анализа [104, 105]. Принцип действия сенсора основан на том, что для различных чистых органических веществ влияние на метаболизм микроорганизмов приводит к индивидуальной зависимой от времени в динамике падения концентрации кислорода. Данные хемометрического анализа подтвердили, что сигналы на отдельные вещества в смеси имеют линейный характер и являются добавочными. Таким образом, возможен анализ многокомпонентной смеси с использованием одного динамического микробного сенсора [105].

Областью применения микробных сенсоров является пищевая  промышленность, контроль ферментационных процессов, диагностика ряда заболеваний, анализ объектов окружающей среды. Последний аспект применения микробных сенсоров будет рассмотрен подробнее.

2.2.2.1. Микробные сенсоры в мониторинге  газовых и водных сред.

2.2.2.1.1. Мониторинг атмосферы

Одним из аспектов отрицательного влияния промышленной деятельности человека на атмосферу является увеличение концентрации СО₂, приводящее к парниковому эффекту. Помимо углекислого газа в атмосферу выбрасываются большие количества NO₂, NH₃, SO₂, SO₃, CH₄ и других токсичных веществ. Биосенсорная детекция перспективна для мониторинга CO₂, NO₂, NH₃, CH₄.

В настоящее  время разработаны сенсоры для определения СО₂ с использованием автотрофных микроорганизмов на основе кислородного электрода с линейным диапазоном концентраций СО₂ 3 - 12 % и временем жизни более 1 месяца [106]. Для определения СО₂ в водном растворе создан сенсор на основе почвенных бактерий S - 17, выделенных из префектуры Akita, Japan [107] и кислородного электрода с линейным диапазоном детекции 200ррМ СО₂ (8×10^-3М К₂СО₃) и нижним пределом детекции 5 ррМ СО₂ (200 ×10^-6 мкМ К₂СО₃). Верхний предел определялся насыщением СО₂ в буферном растворе. Время ответа сенсора составляло 2 - 5 мин, время жизни - более 3 недель при 30^оС [107].

Микробный сенсор на основе клеток Thiobacillus thioparus, иммобилизованных между двумя нитроцеллюлозными мембранами, и кислородного электрода, использовался  для определения SO₃ [108]. Амперометрический сенсор на основе Nitrobacter sp., который метаболизирует нитриты в качестве единственного источника энергии, был применен для их детекции [109].

Описан амперометрический  датчик для определения аммония в сточных водах на основе двух штаммов нитрифицирующих бактерий, способных производить деградацию аммония с потреблением кислорода. Показана возможность его применения для мониторинга атмосферы [110]. Разработан сенсор для детекции NH₄⁺, содержащий иммобилизованные микроорганизмы (Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Trichosporon cutaneum) в соединении с электрохимическим преобразователем. Время ответа сенсора составило 10 - 15 с, линейный диапазон концентраций от 5×10^-9 до 15×10^-8 М аммония и время жизни 12 дней [15]. В работе [111] достигнут нижний предел детекции NH₄⁺ 6×10^-9 М.

Предложен микросенсор  для определения NO с временем ответа 1 мин и временем жизни несколько  дней. Единственным мешающим соединением  для данного сенсора являлся N₂O [101].

Предел детекции амперометрического сенсора для определения летучих органических соединений в форме аэрозолей, в частности перхлорэтилена (тетрахлорэтилена) с использованием микроводоросли Chlorella, составил 10 ррМ. Сенсор обладал линейным диапазоном 10 - 250 ррМ и временем полужизни 8 дней [112]. Данный метод может быть применим для веществ, влияющих на фотосинтез.

2.2.2.1.2. Мониторинг гидросферы

Отрицательное влияние промышленной деятельности человека сказывается и на состоянии поверхностных и подземных сточных вод, биосфере мирового океана. Для мониторинга водных поллютантов также предложен ряд биосенсоров. Так, биосенсор для детекции Н₂О₂ создан на основе Bacillus subtilis AS1398. Рабочий диапазон сенсора составлял 10 - 2000×10^-3 М, время жизни 65 дней. Сенсор характеризовался высокой селективностью и воспроизводимостью [113].

Биосенсор для определения  концентрации формальдегида на основе клеток метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha А3 - 11 и потенциометрических рН-чувствительных полевых транзисторов обладал линейным диапазоном от 2×10^-3 до 200×10^-3 М, временем жизни 42 ч при введении проб каждые 20 мин и нижним пределом детекции 0.5×10^-3 М [114]. На основе lux-меченых бактерий разработан сенсор для детекции фенантрена, пирена, бензапирена [115].

Escherichia coli DH5a с геном alk из Pseudomonas oleovorans использована в качестве биорецептора сенсора для определения алканов. Для октана диапазон детекции составил 24 ×10^-9- 100 ×10^-9 М [116]. Гриб Aspergillus ustus применили в сенсоре для определения танниновой кислоты. Рабочий диапазон сенсора составил (0.025 - 1.025) ×10^-3 М [87].

С помощью микробных биосенсоров  можно производить детекцию высокомолекулярных соединений. Так, на основе клеток Nocardia opaca, иммобилизованных в полиакриламид, и вращающегося стеклоуглеродного электрода разработан сенсор для определения стероидов с диапазоном детекции 2.5×10^-9 – 0,1×10^-6 М [117]. Детекция микотоксинов (катулин, ронефортин, токсин Т - 2) была возможна с помощью Tetrahymena termophyla [118]. Для определения концентрации цитохрома применен цианид-устойчивый Klebsiella oxytoca [119].

Сенсор, чувствительный к  спектру флуоресценции фикоцианина, способен обеспечить облегченный мониторинг концентрации цианобактерий и предупредить о наступлении сезона цветения водорослей [20]. Предлагается биосенсор для мониторинга концентрации Chatomella marina , которая является основной составляющей красных приливов, на основе хемилюминесценции, происходящей в результате образования супероксидов этими водорослями [120].

2.2.2.2. Классы соединений, детектируемых с помощью микробных биосенсоров

2.2.2.2.1. Определение  БПК

Биохимическое потребление  кислорода (БПК) как индикатор количества биодеградабельных органических компонентов широко используется для контроля качества очистки сточных вод. Общепринятый тест на БПК занимает 5 дней и вследствие этого непригоден для использования в процессах прямого контроля. Более быстрая оценка БПК возможна при использовании электрохимического микробного сенсора.

Традиционный метод БПК₅ позволяет в основном определить сумму растворенных высокомолекулярных органических соединений, с помощью биосенсора можно определить также и низкомолекулярные биодеградабельные органические соединения в сточной воде. Критерием подбора микроорганизмов для использования их в БПК-сенсоре является широкий спектр потребляемых субстратов. Поэтому часто в биорецепторе таких сенсоров используются активированные илы, получаемые из отработанных сточных вод заводов и содержащие смешанные популяции микроорганизмов, поскольку отдельно взятый вид имеет узкий по сравнению с консорциумом спектр субстратов и может детектировать лишь часть компонент сточных вод [121, 122]. Однако, сенсоры на основе бактерий активного ила, как правило, дают трудновоспроизводимые сигналы.

Чистые культуры не обладают таким недостатком, и потому являются более приемлемыми для разработок сенсоров; в качестве примеров можно привести модели сенсоров на основе дрожжей Trichosporon cutaneum, обладающих низкой избирательностью и высокой дыхательной активностью, рабочим диапазоном концентраций от 3 до 60 мг/л и относительной ошибкой 6%., на основе которого был создан коммерческий анализатор БПК [123]. Предложен сенсор для определения БПК с использованием клеток T.cutaneum, иммобилизованных в поливиниловый спирт и позволяющий производить измерение БПК с очень коротким временем ответа (менее 30 с), рабочей стабильностью 48 дней и нижним пределом детекции 4 мг/л БПК [102]. С использованием T. cutaneum, иммобилизованных на пористой ацетилцеллюлозной мембране, и кислородного электрода Кларка создан также сенсор для детекции БПК с временем анализа (до восстановления сенсора) 10 мин и нижним пределом детекции 5 мг/ л. Мешающим веществом являлась ксилоза, присутствие которой приводило к снижению величины сигнала, по всей видимости, ввиду медленного разложения этого соединения [107]. Использовался T. cutaneum и при создании сенсора для анализа крахмалосодержащих сточных вод. Сенсор был стабилен более двух месяцев при хранении и месяц в рабочих условиях [124]. Разработан портативный микробный сенсор для определения БПК на основе клеток дрожжей T. cutaneum, непосредственно иммобилизованных на поверхности кислородного электрода Кларка. Время ответа составляло 7 - 20 мин. при 20^о С, динамический диапазон от 0 до 16 мг/ л БПК и нижний предел детекции 0.2 мг/ л БПК при использовании стандартного глюкозо-глютаматного раствора БПК. Время жизни сенсора составило 8 дней, в рабочих условиях 8 часов [125]. Предложены сенсоры на основе дрожжевых и бактериальных клеток с линейным диапазоном концентраций 1 - 45 мг/л БПК [126].

В качестве рецепторных элементов  сенсоров для определения БПК  использовались также Hansenula anomala, Pseudomonas A4,Clostridium butyricum и B.subtilis [127]. Сенсор на основе кислородного электрода и клеток дрожжей для определения БПК₅ обладал нижним пределом детекции 3 мг/л БПК [111]. Предложены сенсоры на основе смешанных культур с использованием комбинации двух микроорганизмов с различным спектром субстратов, Rhodococcus erythropolis и Issatchenkia orientalis с коротким временем анализа (2 мин) [121], на основе смешанной культуры Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis 7B с временем жизни более 2 месяцев [128]. Датчики соединяли избирательность обоих штаммов и их способность усваивать широкий спектр субстратов. Результаты, полученные с БПК-сенсорами при анализе сточных вод, коррелировали с результатами классического метода.

Для оценки БПК изготовлен также микробный сенсор на основе Serratia marcescens LSV-4 и кислородного электрода. Сенсор был нечувствителен к рН в диапазоне 6.0 - 8.0. В незабуференном растворе ионы Cu²⁺, Ag⁺, Cd²⁺, Zn²⁺ вызывали существенное уменьшение амплитуды отклика БПК-сенсора [129]. Разработан [130] микробный сенсор на основе бактерий Bacillus licheniformis 7B, устойчивый к таким тяжелым металлам как Fe²⁺, Fe³⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Cr²⁺, Pb²⁺, Sn²⁺, Al³⁺, Mn²⁺ (в концентрации 4×10^-3 М). Сенсор для определения БПК предложен на основе устойчивого к присутствию тяжелых металлов штамма Alcaligenes eutrophus KTO-2, выделенного из почвы завода по переработке сточных вод с временем ответа 80 с, воспроизводимостью 2%, скоростью анализа 8 образцов в час и оперативным временем жизни более 30 дней. Сенсорный элемент был устойчив и позволял производить измерения в присутствии ионов Ni²⁺, Co²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺ [131].

Одноразовый амперометрический микробный сенсор был разработан для определения БПК при нитрификации (N - БПК) на основе нитрифицирующих бактерий. Время ответа при измерении N - БПК стандартных растворов аммония и образцов сточной воды составляло 6 - 12 минут [132].

Корреляция  между величиной БПК, полученной сенсорным методом и методом  БПК₅ при анализе сточных вод, позволяет сделать следующие выводы [102]:

1). После калибровки  величина БПК, полученная сенсором, отражает истинный объем органических  соединений в водном растворе,

2). Различный  состав сточных вод не оказывает  влияния на результаты измерения  сенсора,

3). Для различных  сточных вод определенного типа  расхождение величин БПК, полученных сенсорным методом и методом БПК₅, находится в определенном диапазоне,

4). Сенсорные измерения являются адекватным методом для контроля быстрых биотехнологических процессов.

Одной из нерешенных проблем БПК - сенсора является повреждение  микробных клеток веществами, содержащимися  в сточных водах. Электроды, содержащие отравленные микроорганизмы, показывают более низкое, чем в действительности, БПК и поэтому непригодны для работы. В этих случаях необходима тщательная калибровка сенсора с помощью стандартных растворов [127].

2.2.2.2.2. Детекция мутагенов и поллютантов

Вещества, обладающие мутагенным эффектом, также образуются в процессе производственной деятельности человека. Проблема их определения в объектах окружающей среды также актуальна. К настоящему времени описан ряд моделей микробных сенсоров для детекции мутагенов [111]. Показана перспективность использования для этих целей биосенсоров с интегральным ответом [133]. Подобные методы являются более быстрыми, селективными и дешевыми, чем тесты с использованием животных. Так, предварительный скрининг на мутагены был произведен с помощью системы, содержащей два микробных сенсора, на основе рекомбинантного штамма Bacillus subtilis или Salmonella typhimurium (REC^-) и дикого штамма (REC⁺), соответственно. Измерение было основано на разнице в способности к репарации поврежденной ДНК у дикого и рекомбинантного штамма и, соответственно, способности их к выживанию. Чувствительность этой сенсорной системы была в 3 - 6 раз выше, чем у общепринятых методов (минимальная детектируемая концентрация мутагена AF - 2 составляла 1 ´ 10^-6 мг/ см³) [127]. Сенсор для определения трихлорэтилена предложен на основе Nitrosoma [134]. Для предварительного скрининга мутагенов с использованием теста на фаговую индукцию использовался лизогенный штамм Escherichia coli GYS027 и нелизогенный штамм GYS026 в комбинации с кислородным электродом. Введение в среду мутагена, такого как AF - 2 и MNNG приводило к фаговой индукции лизогенного штамма пропорционально концентрации мутагенов и ингибированию дыхания только лизогенного штамма, иммобилизованного на электроде. [135, 127].

Бактериальная система биодетекции  позволяла производить определение генотоксинов в окружающей среде с временем регистрации порядка 1 мин. Этот клеточный детектор основан на ответе сенсора с SOS-системой в качестве рецептора, чувствительного к повреждению ДНК и биолюминесцентной системы в качестве оптического сигнала. Для ММС получен нижний предел детекции 4.3 10^-8М. [136]. Аналогичная система с использованием SOS-lux теста была предложена для оценки острой токсичности полициклических ароматических углеводородов, в частности, фенантрена и бензапирена [137] с использованием Rhizobium biovar trifolii TAI luxAB [115].

Амперометрический биосенсор  для определения ингибиторов  нитрификации по потреблению кислорода был разработан на основе смешанной нитрифицирующей культуры [138]. Был сконструирован биосенсор для детекции ряда биологически активных тяжелых металлов. Наличие в клетках промоторов luxcDABE-reporter системы обусловливало биолюминесцентный или флюоресцентный сигнал в ответ на присутствие в среде тяжелых металлов. [139].