Организация микробиологической и иммунологической лаборатории

Зигомицеты. Класс грибов, объединяющий виды с хорошо развитым неклеточным или в зрелом состоянии разделённым на клетки мицелием. Размножение бесполое (спорангиоспорами и конидиями). Характерен особый тип полового процесса — зигогамия (слияние двух недифференцированных на гаметы клеток). Поражения у человека чаще вызывают различные виды Absidia, Mucor и Rhizopus, реже — представители родов Entomophthora, Conidiobolus и Basidiobolus. Заболевания полиморфны, и их условно можно разделить на 6 основных типов (учитывая место проникновения и локализацию поражений) — риноцеребральные, лёгочные, кожные, подкожные, желудочно-кишечные и поражения ЦНС. Грибы распространены повсеместно, колонизируют различные органические субстраты, почву и т.д. Основные группы риска включают пациентов с трансплантатами органов, иммунодефицитами и диабетическим кетоацидозом. Поражения регистрируют повсеместно, исключая энтомофторамикозы; возбудители последних (грибы родов Basidiobolus и Conidiobolus) распространены в почве повсеместно, но вызывают поражения в эндемичных районах. Отличительная черта возбудителей — наличие больших несептированных гиф, инвазирующих ткани и окружённых эозино-фильными инфильтратами. Выделяют базидиоболярный энтомофторамикоз (подкожный фикомикоз) и конидиоболярный энтомофторамикоз. Возбудитель первого — Basidiobolus ranarum, для него характерно наличие подкожных фиброзных инфильтратов, но изъязвлений гранулём обычно не наблюдают. Реже поражаются более глубокие ткани — мышцы и лимфатические узлы. Заболевания регистрируют в Индонезии, Африке (наиболее часто в Уганде). В Новом Свете базидиоболярный энтомофторамикоз не регистрируют. Конидиоболярный энтомофторамикоз вызывает Conidiobolus coronatus; для заболевания характерно образование больших полипов и гранулём в носовой полости; заболевание встречается в Техасе, Вест-Индии, Бразилии, Колумбии и странах тропической Африки.

Культуральные свойства. Зигомицеты хорошо и быстро растут на обычных средах, образуя воздушные гифы на поверхности питательной среды. Гифы некоторых представителей рода Rhizopus формируют «усы», или столоны, протягивающиеся на значительное расстояние (порядка нескольких сантиметров). Гифы зигомицетов образуют ценоцитный таллом, т.к. не имеют перегородок и потому многоядерны. Отличительная особенность представителей рода Мисог — способность образовывать рыжевато-коричневые конидии. Для инвазив-ного роста зигомицетов характерны беспорядочно ветвящиеся большие ценоцитные гифы.

Патогенез и клинические проявления. Заболевание начинается с прорастания ингали-рованных конидий в лёгких.  Возбудитель быстро вегетирует; возможна его пенетрация через решётчатую пластинку решётчатой кости в головной мозг (поражения чаще наблюдают у лиц, страдающих сахарным диабетом). Подобные ситуации характеризуют боли в лобной области и слепота вследствие поражений глазного нерва. Заболевания протекают молниеносно и с высокой летальностью.  Возможны поражения дыхательных путей; заболевание быстро прогрессирует и клинически напоминает инвазивный бронхолёгочный аспергиллёз. Кожные поражения могут быть следствием первичной инфекции, например при ношении загрязнённых бандажей, при травмах (особенно у больных сахарным диабетом), ожогах и (редко) после внутримышечных инъекций. Также могут развиваться вторично при диссе-минировании возбудителя. Основное клиническое проявление — целлюлит.  Желудочно-кишечные поражения наблюдают у крайне истощённых лиц. Их характеризует быстро прогрессирующая клиническая картина пищевых токсикоинфекций, и они часто заканчиваются гибелью больного.

Лабораторная диагностика. Выделение и идентификация зигомицетов не составляет никаких трудностей, однако их широкое распространение ставит специалиста перед проблемами, аналогичными таковым при диагностике аспергиллёзов. Косвенное доказательство — постоянное выделение микроорганизмов из поражённых органов. В биоптатах поражённых тканей выявляют беспорядочно ветвящиеся большие ценоцитные гифы.  Зигомицеты неплохо растут на микологических средах без циклогексимида, образуют шерстистые серые, коричневые, черно-серые колонии через 1-3 сут.

Патогенные диморфные грибы

Характерная особенность представителей — способность  давать плесневой рост в природных  условиях или при выращивании in vitro на питательных средах при комнатной температуре и образовывать дрожжеподобные клетки при инвазии в ткани или in vitro при температуре 37 ⁰С. Культуральная форма представлена ветвистыми гифами с терминальными или латеральными ко-нидиеносцами, несущими овальные конидии; тканевые формы — дрожжеподобные клетки с двух-контурной оболочкой.

Blastomyces dermatitidis. Вызывает бластомикоз (болезнь Джилкрайста, устар. Северо-Американский бластомикоз) — локальный или системный микоз; наиболее часто наблюдают поражения кожи, лёгких и других внутренних органов. Возбудитель размножается половым и бесполым путём; половая форма систематизирована, как Ajellomyces dermatitidis. В. dermatitidis обитает в почве и на разлагающихся растительных остатках. Наибольшую заболеваемость регистрируют у работников сельского хозяйства и лиц прочих профессий, связанных с пребыванием на открытом воздухе в эндемических очагах. Заболевание впервые описано Джилкрайстом (1894), посчитавшим его протозойной инфекцией. Роль лёгких как органа-мишени доказана лишь в 1951 г. (Шварц и Ба'ум). У человека выделяют следующие клинические формы: первичный лёгочный, прогрессирующий лёгочный, первичный кожный и диссеминированный бластомикозы. В соответствии со структурой экзо-антигенов дрожжевых клеток у В. dermatitidis выделяют серотипы А и В; повсеместно (кроме Африки) более распространён серотип А. Эпидемиология заболевания остаётся малоизученной (по сравнению с прочими микозами), что объясняется отсутствием адекватных диагностических тестов. В США выделены эндемичные области в бассейне Миссисипи и на юго-востоке страны; заболевание также регистрируют в Канаде, Латинской Америке, Африке и Израиле.

Культуральные особенности. В. dermatitidis — аэроб, растущий при 20-37 °С. На плотных средах образует беловато-жёлтые волокнистые колонии (молодые культуры напоминают колонии Н. capsulatum) с воздушным мицелием. Гифы возбудителя имеют перегородки и округлые конидии. Культивирование при 37 °С на КА способствует росту колоний, образованных дрожжеподобными (8-15 мкм) клетками с толстой двуслойной клеточной стенкой. Отпочковывающиеся клетки имеют характерную широкую перетяжку (рис. 35-16).

Клинические проявления. Первичные формы.  Первичный лёгочный бластомикоз обычно протекает легко и трудно диагностируется. Идентификация фозбудителя возможна лишь по данным кожных проб.  Прогрессирующая лёгочная патология развивается значительно реже, клинически напоминает лёгочные болезни злокачественного роста, туберкулёз и другие респираторные микозы. Заболевание сопровождают лихорадка, продуктивный кашель и боли в груди; иногда наблюдают регионарную лимфаденопатию. Хронические или рецидивирующие поражения развиваются либо в результате острого поражения, либо как следствие реактивации процесса, иногда из внелёгочного очага. Клинические проявления аналогичны таковым при хронических пневмониях.  Первичный кожный бластомикоз составляет 40-80% всех поражений. Характерно развитие очагов двух типов: папулёзных, трансформирующихся в веррукозные поражения красно-фиолетового цвета, и пустулёзных, образующих большие язвенные дефекты. Значительно реже (по сравнению с гистоплазмозом) наблюдают поражения слизистых оболочек рта, носа и зева. Некротические процессы в очагах с последующим фиброзом приводят к образованию грубых рубцов, обезображивающих лицо. Диссеминированное заболевание протекает с вовлечением кожи, внутренних органов и костей (остеомиелиты). Поражения костей наблюдают в 60% случаев диссеминированных поражений. Очаги возникают в позвонках, рёбрах, длинных трубчатых костях и костях черепа. У 3-5% больных наблюдают инфекционные артриты, развивающиеся гематоген-но или из прилегающих очагов; наиболее часто отмечают поражения одного сустава (обычного коленного).  Также возможны поражения печени, селезёнки, перикарда, щитовидной железы, глаз и органов мочеполовой системы, включая предстательную железу.

Лабораторная диагностика. Распознавание бластомикоза требует привлечения квалифицированного специалиста, т.к. наиболее простой и доступный способ — выявление возбудителя микроскопией лабораторного материала, тогда как выделение культуры подтверждает предварительный диагноз. Забор образцов производят в зависимости от типа и локализации поражений (при любой форме биопсия желательна). Микроскопия. Наличие в гнойном отделяемом и биоптатах дрожжеподобных клеток с толстой стенкой характерных широких перетяжек у почкующихся особей даёт серьёзные основания для подозрений на бластомикоз. Возбудитель можно обнаружить как после обработки образцов раствором гидроксида калия, так и при окраске гистологических препаратов по Райту или Романовскому-Гимзе. Основание для окончательного диагноза — выделение возбудителя.  После длительной инкубации (4 нед и более) при комнатной температуре бластомицеты образуют белые складчатые либо восковидные макроколонии. По мере роста воздушных гиф они становятся серыми или коричневыми. Гифы септированные диаметром 1-2 мкм; конидии одноклеточные овальные или грушевидные, напоминают леденцы на палочках. Строение гиф и конидий не относится к дифференциальным признакам (аналогичные выделяют у Pseudoallescheria boydii и Chrysosporium), и идентификацию возбудителя по их морфологии не проводят.

(2) Для определения  способности к диморфному росту  большой инокулят плесневой культуры вносят в агар с экстрактом сердца и мозга, дополненный 10% эритроцитов барана, или в агар с цистеином и гемоглобином. В течение 7-10 сут при 37 "С он образует кремовато-жёлтые (цвета сливочного масла) колонии, сформированные типичными дрожжеподобными клетками.  Серологические исследования и кожные пробы.  Ранее широко применяли РСК с коммерческим антигенным диагностикумом, однако в 50% случаев титры комплементсвязывающих AT низкие, что ограничивает диагностическую ценность РСК.  Более эффективна реакция иммунодиффузии — результаты бывают положительными у 80% пациентов уже через 2-3 нед после начала заболевания; реакция имеет 100% специфичность.  Кожные пробы проводят путём введения экстракта грибковых клеток (бластоми-цин). Результаты кожных проб достаточно неспецифичны и не имеют большой диагностической ценности, т.к. они могут быть результатом перекрёстной гиперчувствительности.  Проба с экзоантигеном позволяет быстро идентифицировать гифальные формы. Для этого проводят реакцию двойной иммунодиффузии с водным экстрактом 7-10-дневной мицелиальной колонии и стандартной антисывороткой. Проба положительна у всех больных.  Также разработан метод идентификации нуклеиновых кислот бластомицетов, позволяющий быстро идентифицировать возбудитель.

Sporothrix schenckii. Вызывает споротрихоз (болезнь Шёнка-Бёрмана) — хроническое локальное поражение подкожной клетчатки, возникающее после имплантации возбудителя в рану. Распространяется по лимфатическим путям; генерализацию процесса с вовлечением костей, суставов, лёгких и ЦНС наблюдают редко. Возбудитель впервые описан Шёнком (1898); S. schenckii выделяют из почвы, гниющих органических остатков и с поверхности растений (например, шипов роз, сфагнума). Заболевание наиболее распространено среди работников сельского хозяйства и садоводов-любителей; также известно под бытовым названием «болезнь любителей роз». Возбудитель — аэроб, на агаре Сабуро при температуре 20-25 °С формирует складчатые колонии белого, серого, бурого, коричневого или тёмного цвета, образованные септированным мицелием с простыми конидиями двух типов: в виде гроздей («цветки маргариток») и «сидячие», более тёмного цвета. Тканевая форма представлена овальными или веретенообразными клетками.

Клинические проявления. Некоторые авторы выделяют рассеянную гранулематозную форму (болезнь Бёрмана), гранулематозный лимфангиит (болезнь Шенка) и полиабсцеди-рующие поражения (болезнь Дори). Основными считают лимфогранулематозные поражения. Инкубационный период варьирует от 1 до 12 нед. Первое проявление — красная папула, позднее изъязвляющаяся; возможно выделение незначительных количеств серозно-геморрагического экссудата. Позднее появляются вторичные поражения, располагающиеся проксимальнее по ходу лимфатического сосуда. В 15-20% случаев возможны вторичные поражения костей и суставов конечностей. У трети больных наблюдают локальные и полиморфные кожные поражения, они могут быть язвенными, веррукозными, папилломатозными, эритематозными и т.д. Очаги преимущественно располагаются на конечностях и лице и не сопровождаются вовлечением лимфатической системы. Споротрихоз редко бывает следствием травм или ранений, исключая поражения глаз. Инфекционный процесс может вовлекать веки, конъюнктиву, носослёзный канал и глазницу.

Лабораторная диагностика. Заболевание распознают выделением и индикацией возбудителя. Микроскопия. Незначительное количество S. schenckii в биоптатах и гнойном отделяемом затрудняет его выявление в мазках, даже после дифференцирующей импрегнации серебром. В поражённых тканях возбудитель представлен дрожжеподобными сигаровид-ными клетками (3-5 мкм). Диагностический признак споротрихоза — астероидные тельца, образованные дрожжеподобными клетками, окружёнными радиально расположенными аморфными структурами. Выделение возбудителя на обычных микологических средах с последующей идентификацией изолятов по морфологии колоний и в мазках даёт основание для окончательного диагноза. При комнатной температуре возбудитель образует медленно растущие колонии различного цвета. Культивирование при 37 "С способствует образованию дрожжеподобных клеток. Биологическая проба. Трансформацию мицелиальной формы в дрожжевую можно наблюдать при интратестикулярном введении гиф белым мышам. Тест позволяет дифференцировать возбудитель от разнообразных морфологически сходных сапрофитов. Серологические исследования. AT к Аг возбудителя выявляют в РА, непрямой латекс-агглютинации, РСК, РП, ИФА и др.

Loboa loboi (Glenosporella lobo, Paracoccidioides lobo, Blastomyces lobo). Диморфный гриб, вызывает лобомикоз (гленоспореллоз, келоидный бластомикоз Лобо, амазонский бластоми-коз) — хронический глубокий микоз с кожными поражениями и образованием келоидоподоб-ных рубцов. Заболевание впервые описано Лобо (1931) как разновидность паракокцидиоидоми-коза. До 70-х гг. считали, что природный резервуар возбудителя — человек, но затем поражения были обнаружены и у дельфинов-бутылконосов. Эпидемиология лобомикоза остаётся плохо изученной, т.к. всего зарегистрировано более 100 случаев. Заболевание эндемично для бассейна Амазонки (более 80 случаев), спорадически регистрируют в Коста-Рике, Венесуэле, Колумбии, Французской Гвиане и Панаме. Группа риска — лица, работающие на лесоповале и проживающие в отдалённых лесных районах. Несколько случаев, зарегистрированных в Европе у лиц, контактировавших с Атлантическими дельфинами, указывает на возможность передачи возбудителя от животного человеку. Тканевая фаза представлена сравнительно большими (8-16 мкм), круглыми, овальными или напоминающими лимон дрожжеподобными клетками с 1-2 дочерними почками. Культивируются с трудом, при температуре 25 °С образуют белые гладкие или слегка пушистые колонии. Переход гифальной стадии в дрожжеподобную можно индуцировать культивированием гриба при температуре 37 "С (колонии сероватые).

  Клинические проявления. Характерные высыпание на коже плотных узелков, бугристых келоидоподобных и опухолевидных узлов, а также бородавчатых образований с лоснящейся поверхностью. Узлы могут сливаться, образуя редко изъязвляющиеся массивные бугристые инфильтраты. Очаги локализуются на голенях, стопах, предплечьях, ушах и ягодицах. Изредка наблюдают регионарные лимфадениты, обычно при присоединении бактериальных инфекций. Течение хроническое и доброкачественное.